目的：银屑病是一种多病因、机制复杂的难治性皮肤病,根据银屑病不同的临床表现,中医将其划分为“血瘀”、“血燥”、“血热”等证型,国医大师榻国维认为“血瘀”这一病理状态贯穿银屑病始终,是影响发病、转归和预后的重要因素。本文首先通过观察血瘀银屑病患者血液状态及红细胞形态等临床指标,验证银屑病患者血液异常与银屑病发展相关的理论,然后通过建立血瘀-银屑病病证结合模型和脾切除致银屑病动物模型来探讨血瘀致银屑病的机制,为基于中医理论的银屑病治疗机制探讨及新药研发奠定基础。方法：1血瘀型银屑病患者血液状态评价1.1血瘀型银屑病患者血液标本收集根据纳入和排除标准收集50名寻常型银屑病患者、30名健康志愿者外周静脉血液标本,检测血粘度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞压积、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇等指标。1.2血涂片制作及红细胞形态观察采血4h内制作红细胞血涂片,制片后24 h内在100×正置显微镜下随机选取3个不同视野观察,分别记录异形红细胞数和视野内红细胞总数,计算镜下红细胞异形率、红细胞异形率。1.3密度梯度法分离红细胞实验将全血标本制备成滤白红细胞,之后采用密度梯度法将银屑病患者和健康志愿者的滤白红细胞分离。将细胞分离液配置成五个不同密度层置于玻璃管中,其密度自上而下依次为1.0910g/mL、1.0985g/mL、1.1060g/mL、1.1135g/mL、 1.1210g/mL,加入红细胞后离心,红细胞分布在密度相近的细胞分离液层,自上而下,红细胞老化程度不断增大,用游标卡尺测量不同密度层厚度。2血瘀致银屑病动物模型的建立及评价2.1血瘀致银屑病动物模型的建立采用寒凝气虚致血瘀法、气滞致血瘀法建立血瘀模型。32只昆明种小鼠,雌雄各半,采用分层随机法分为Blank (Blank)、Control (Control)、寒凝气虚血瘀银屑病组(Psoriasis with Congealing cold and Qi-deficiency Blood Stasis, PCQBS)和气滞血瘀银屑病组(Psoriasis with Qi Stagnancy and Blood Stasis, PQSBS)。PCQBS造模采用寒凝血瘀、气虚血瘀复合法,将小鼠放入4-6℃冰水中每日游泳30min,同时将每日喂食量减少至正常小鼠的1/3(约lg·10g-1); PQSBS选用束缚法复合夹尾法造模,将小鼠装入小鼠尾静脉注射固定器中6h/d,并给予夹尾刺激5min,其余时间正常活动和饮食。连续造模14d,将鼠尾根部以上3cm*2cm长方形皮肤上被毛除去,除Blank外其他各组均涂抹5%普萘洛尔微乳制剂诱导银屑病模型,以将裸露皮肤完全覆盖但不向两侧流动为宜,Blank不予处理,每日拍照记录,并观察皮肤情况。2.2血瘀致银屑病动物模型的评价观察并记录小鼠一般情况。涂药第5天采血,以旋转式血粘度检测法测定全血粘度；使用千分之一天平精密称取PCQBS.CQBS.Control和Blank动物的脾脏、胸腺重量,计算各组小鼠脾指数、胸腺指数；处死动物,取皮损皮肤,将皮肤组织放入福尔马林溶液中固定后制作HE染色病理切片,观察组织病理切片特点,根据多个指标进行综合评价、筛选具有典型特征的血瘀致银屑病动物模型。2.3血瘀致银屑病动物模型中炎症因子、能量代谢能力的变化昆明小鼠36只,分为Blank(Blank)、Control(Control).CQBS(Congealing cold and qi-deficiency blood stasis,CQBS)、PCQBS(Psoriasis with congea]ing cold and qi-deficiency blood,PCQBS)。CQBS、PCQBS模型动物,造模方法如前,但取材时间提前,涂药第4d处死取材。精密称取0.1g皮肤组织,使用Trizol裂解液裂解皮肤提取总RNA,经逆转录、扩增后比较各组模型动物皮肤组织中Keratin-16、IL-6、IL-22、IL-23等炎症因子的表达水平；精密称取0.02g皮肤组织,提取蛋白后使用ELISA试剂盒检测IL-6、IL-22、IL-23等因子蛋白表达。使用实时荧光定量PCR法、ELISA法检测模型动物皮肤组织中血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子(HIF)基因及蛋白表达水平。涂药后第4d使用红外测温仪检测造模部位皮肤温度,应用软件处理后进行比较；动物处死后采集血液标本,测定血清中T-ATP酶、MAD、T-SOD.NO含量及活力；取二分之一脾脏丙二醛固定后通过透射电镜扫描,观察脾脏线粒体、内质网等超微结构变化。3血瘀致银屑病机制初探3.1模型建立昆明小鼠40只,分层随机法分为Blank(Blank).Control (Control)、假手术组(Sham Operation,SO).脾切除模型组(Splenectomy model,SM)、脾切除+普萘洛尔组(Splenectomy+Propranolol,SP)五组。脾切除+普萘洛尔组(SP)、脾切除模型组(SM)行部分脾切除术,打开腹腔后将脾脏切除三分之一,假手术组(SO)则只打开腹腔,不施加其他处理因素,缝合后恢复性饲养三天,剔除有感染迹象和死亡小鼠。术后三天将五组小鼠给予脱毛处理,适应性饲养一天,减少脱毛对皮肤状况的干扰。之后在脾切除+普萘洛尔组(SP)、假手术组(SO).Control(Control)皮肤表面均匀涂抹5%普萘洛尔微乳制剂50uL,其余两组不处理。涂药第4d取材,乙醚麻醉小鼠后心脏采血,待小鼠失血休克后处死,取胸腺、皮肤。3.2模型评价精密称取各组小鼠胸腺重量,并结合动物体重计算胸腺指数；观察各组小鼠一般状况,并拍照记录皮肤变化；剪取3×3mmm2皮肤置于10倍体积福尔马林溶液中固定,制作HE染色病理切片。3.3脾切除致银屑病动物模型的机制探讨取各组动物的皮肤组织,使用实时荧光定量PCR法检测模型动物皮肤组织中K-16、IL-6、VEGF、HIF基因表达水平,使用ELISA法检测IL-6、IL-22、VEGF和HIF蛋白表达水平,检测血清中NO水平。结果：1血瘀型银屑病患者血液状态评价1.1血瘀型银屑病患者血液基本状态改变与正常参考值相比,银屑病患者红细胞刚性指数、全血粘度(中切)、全血粘度(高切)、甘油三酯四项指标检测值高于参考值上限；全血粘度(低切)、胆固醇两项指标检测值正常偏高。1.2红细胞形态观察通过制作血涂片观察红细胞发现银屑病患者红细胞形状与健康志愿者相比发生变化,可见棘形、轮状、水滴形等异形状红细胞。30例健康志愿者中,有3例发现有异形红细胞,在人群占比为10%；银屑病患者50例中,有42例发现异形红细胞,占比84%；在出现异形红细胞的血液涂片中,银屑病患者血涂片镜下红细胞异形率为2.44%,健康志愿者镜下红细胞异形率仅为0.014%,显著低于银屑病患者。银屑病患者中,红细胞异形率从0-13.25%不等,多数在1%-6%范围内,显示银屑病患者异常红细胞显著高于正常人。1.3密度梯度法分离红细胞健康志愿者各密度层均有红细胞分布,位于玻璃管上部的密度层中红细胞分布厚度较大；而银屑病患者低密度层红细胞缺失或分布量少,高密度层分布较多。提示银屑病患者红细胞老化程度较健康志愿者高。2血瘀致银屑病动物模型的建立及评价2.1血瘀致银屑病动物模型的评价2.1.1一般情况观察血瘀造模过程中PCQBS和PQSBS小鼠体重均有不同程度减轻,皮毛无光泽,蜷缩少动,爪甲、皮肤色黯,甚则紫黯。2.1.2血粘度改变Blank与Control比,全血粘度无显著差异,PCQBS、PQSBS与Blank、Control相比,全血粘度显著升高,低切变率情况下表现更为明显；而比较PCQBS与PQSBS,则前者的粘度升高更为显著。2.1.3血瘀模型对脾指数、胸腺指数影响与Blank相比,Control脾指数有降低的趋势,胸腺指数有升高的趋势,但无显著差异；与Control及Blank相比,PCQBS和PQSBS的脾指数均显著降低,胸腺指数均升高,与前文全血粘度的结果相近,由此可见,PCQBS的效果更为明显,胸腺指数是Control的2.27倍。2.1.4外观、病理组织切片特点造模后Blank动物皮肤光滑,颜色正常；Control可见皮肤粗糙、略红,取材时未见红色斑片；两种类型血瘀银屑病模型组涂药处皮肤触之变硬伴斑片、起皮、脱屑,部分动物可见皮肤破溃,分泌物渗出,提示已发生类似银屑病病变。病理组织切片显示Blank颗粒层完整,棘层较薄、基底整齐,真皮层小血管正常；Control颗粒层排列欠清晰,棘层未增厚、基底较整齐；PCQBS、PQSBS较之于Control和Blank可见棘层明显增厚,颗粒层细胞减少或排列异常,真皮层小血管增生、扩张,真皮乳头向下突出,炎细胞浸润,皮肤表面可见炎性分泌物。2.2血瘀致银屑病动物模型中炎症因子、能量代谢能力的变化2.2.1皮肤组织中炎症因子表达实时荧光定量PCR Blank与Control炎症因子K-16、IL-6、IL-22、IL-23的mRNA表达无差异；与Blank相比CQBS皮肤组织中的K-16、IL-6、IL-22、IL-23的mRNA表达无差异；PCQBS皮肤组织中的K-16、 IL-6、IL-22、IL-23表达较之CQBS和Blank显著升高；CQBS皮肤中Keratin-16的mRNA表达降低,并且有低于Blank、Control的趋势。使用ELISA法检测皮肤组织中炎症因子蛋白表达,结果显示,Blank与ControlIL-6、IL-22、IL-23蛋白表达无差异；CDBS皮肤组织中的IL-6、IL-22.IL-23蛋白表达与Blank均无差异；PCDBS与Blank, CDBS相比, IL-6、IL-22、IL-23蛋白表达显著升高,与人类银屑病IL-6、IL-22、IL-23升高特点相比,具有很强的相似性。实时荧光定量PCR检测结果显示,Blank与Control小鼠皮损部位VEGF、HIF mRNA表达无统计学差异；CQBS与Blank相比VEGF表达无差异,HIF表达显著升高；PCQBS与C QBS相比VEGF显著升高,HIF表达则无差异。酶联免疫吸附测定VEGF、HIF蛋白表达,与基因表达趋势一致。红外测温仪检测结果显示,Blank与Contr ol相比皮肤表面温度无统计学差异；CQBS与Blank相比皮肤表面温度有下降趋势,但无统计学差异；PCQBS皮肤表面温度较CQBS显著升高。T-ATP酶、T-SOD、MDA含量和活性测定结果显示,Blank与Control间血清总ATP酶、MDA含量及总SOD活力均无统计学差异；CQBS较之Blank,MDA含量显著升高,但血清总ATP酶、总SOD无差异；与CQBS比较,PCQBS血清总ATP酶显著升高,总SOD活力显著降低,MDA则无显著性差异。血清NO相对含量检测可见Contr ol血清NO相对含量较Blank显著升高;CQBS与Blank相比无显著性差异；PCQBS血清NO相对含量显著高于CQBS,同时与Control目比也显著升高。由脾脏透射电镜扫描图,可观察到脾脏的超微结构。Blank、Control的淋巴细胞核呈圆形或椭圆形,异染色质在细胞核中分布较为均匀,线粒体等细胞器结构基本正常；CQBS、PCQBS细胞之间连接紧密,细胞外形不规则,细胞中可见线粒体发生明显的空泡变性,细胞核呈不规则椭圆形,核中异染色质多常染色质少,胞核较大,胞浆中可见游离的核糖体和粗面内质网。3血瘀致银屑病机制初探3.1脾切除致银屑病对胸腺指数影响Blank与Control间无统计学差异；S0,SM的胸腺指数较Blank相比无差异；SP胸腺指数较SO、SM显著降低。3.2脾切除对模型动物外观及组织病理的影响外观可见,Blank、SO、SM小鼠皮肤光滑,皮色正常；Control表面略粗糙,皮色无异常；SP皮肤色红,表面粗糙、干燥,触之质硬,局部可见皮屑覆盖。病理切片显示,Blank、Control、SO、SM皮肤颗粒层完整,棘层较薄,真皮层炎细胞少量浸润,皮肤表面有少量分泌物；SP颗粒层消失,棘层明显增厚,真皮乳头向下突出,大量炎细胞浸润,皮肤表面分泌物较多。3.3脾切除对皮损组织中K-16、IL-6、VEGF、HIF基因和蛋白表达的影响实时荧光定量PCR结果显示,Blank与Control相比K-16、IL-6、VEGF、HIFmRNA表达无差异；S0、SM较之Blank, K-16、IL-6、VEGF、HIF mRNA表达无差异；SP与SO、SM相比K-16、IL-6、VEGF、HIF表达升高。ELISA检测结果显示,Blank与Control相比K-16、IL-6、VEGF、HIF mRNA表达无差异；SO、SM较之Blank, K-16、IL-6、VEGF、HIF mRNA表达无差异；SP与SO、SM相比K-16、IL-6、VEGF、HIF表达升高。3.4造模后各组小鼠血清NO相对含量变化Blank与Control间无统计学差异；与Blank相比,SO、SM无显著性差异;SP的血清NO相对含量较SO、SM显著升高。结论：1银屑病患者全血标本中血液状态相关指标异常、异形红细胞出现频率及数量增多、红细胞老化程度升高,推测银屑病的发生与血液状态有密切关系。2在血瘀病理状态下诱导银屑病的方法可建立血瘀致银屑病病证结合动物模型,该模型符合血瘀型银屑病患者的基本病理特征,可用于银屑病发病机制研究、中医药治疗银屑病机制研究、新药开发等多个方面。3血瘀致银屑病发病和进展与炎症因子、角蛋白表达升高,局部能量代谢改变,氧化应激反应等有密切关系。4寒凝气虚血瘀的病理状态可对脾脏线粒体等细胞器造成损伤,影响脾脏结构和功能；而脾脏结构和功能受限后通过阻碍免疫系统和红细胞正常发挥生理功能成为血瘀和银屑病发生的共同环节,可能是血瘀致银屑病的作用机制之一。