本文深入探讨了在神经元兴奋-转录偶联过程中，细胞核膜BK通道对于调节神经活动依赖性的基因表达的作用。本研究发现，神经元核膜BK通道通过影响细胞核周隙的钙离子释放，调节CaMKⅣ依赖性的细胞核钙离子信号通路，进而调控神经元活动诱导的CREB转录因子的活化，以及下游靶基因的表达，并且影响了神经元树突分支。　　1.核膜BK通道通过CaMKⅣ依赖性的细胞核钙离子信号通路调节CREB的磷酸化。　　为了进一步证实CaMKⅣ信号通路参与核膜BK通道对CREB磷酸化的调节作用，我们分别用CaMKⅣ信号通路的特异性抑制剂STO-609来阻断CaMKⅣ信号，和ERK信号通路的特异性抑制剂U0126来阻断ERK信号通路，免疫荧光染色结果显示，在分离的功能完整的细胞核上，CaMKⅣ信号通路的阻断剂STO-609有效地阻断了paxilline诱导的CREB磷酸化的升高(P=0.007)，而ERK信号通路的阻断剂U0126没有影响paxilline对CREB磷酸化的促进作用。这提示CaMKIV信号通路，而非ERK信号通路，介导了核膜BK通道对CREB磷酸化的调节作用。　　除了分离的细胞核外，我们在完整的培养海马神经元上也进行了同样的实验。由于在完整细胞上，细胞质膜也表达有大量的BK通道，因此为了排除细胞质膜上BK通道对实验结果造成干扰，所有细胞都用一种BK通道的不能穿透细胞膜的肽类阻断剂IbTx进行了预处理，阻断细胞膜上的BK通道而不影响细胞内的BK通道，以排除在完整细胞上细胞质膜BK通道带来的影响。STO-609阻断了paxilline诱导的CREB磷酸化的升高(P=0.001)，而ERK信号通路的阻断剂U0126没有影响这一作用。这些结果证实了核膜BK通道是通过CaMKⅣ信号通路而非ERK信号通路来调节CREB转录活性。　　通过对培养神经元外源表达shRNA来降低CaMKⅣ表达，我们进一步验证了阻断CaMKⅣ信号通路产生的作用。同样的，在降低CaMKⅣ表达以后，paxilline不能显著提高CREB磷酸化程度(P=0.792)，进一步证明CaMKIV介导了核膜BK通道对CREB磷酸化的调节作用。此外，我们通过另外两种方式抑制CaMKⅣ依赖性的细胞核钙信号通路，一种是外源表达一种定位于细胞核的并且能够螯合钙离子的蛋白质PV-NLS(带有核定位序列的parvalbumin)来缓冲细胞核内的钙浓度升高;另一种是外源表达一种CaMKⅣ的突变体dnCaMKⅣK75E，这个突变体已经失去了它的酶活性，因此是CaMKⅣ的一种显性负性形式，能够竞争性抑制内源性CaMKⅣ的作用。同样地，在外源表达了PV-NLS或者dnCaMKⅣK75E的细胞，paxilline对CREB磷酸化的调节作用减弱了(PV-NLS与dnCaMKⅣK75E组均为P=0.000)。　　以上证据表明，核膜BK通道通过调节核钙浓度，以及CaMKⅣ依赖的核钙信号通路，调控CREB的磷酸化。　　2.核膜BK通道参与调控神经元活动诱导的CREB转录因子活化与基因表达。　　我们首先在培养神经元上使用IbTx封闭细胞膜上的BK通道，以排除细胞膜BK通道可能带来的影响后，我们使用GABA受体阻断剂Bicuculine阻断GABA系统对神经元的抑制作用，通过这种手段提高锥体神经元的兴奋活动。bicuculine的处理可以诱导神经元细胞核内钙离子浓度上升，我们通过免疫荧光染色检测到CREB磷酸化也得到增强(P=0.005)。但是经过paxilline预处理过的神经元在接受bicuculine处理后，细胞核钙信号变化以及CREB活性增加幅度都有减弱(P=0.027)。这可能是由于神经活动引发的细胞核钙信号增强依赖于细胞核周隙钙库的充盈，而paxilline预处理促使细胞核周隙的钙离子排出，减少了核周隙钙库中的钙离子，因此减弱了bucuculine引发的细胞核钙信号。这些实验数据说明核膜的BK通道能够调节兴奋活动引起的细胞核钙信号活动以及CREB磷酸化。为了排除paxilline的作用是由于非特异性地结合了BK通道以外的其它靶点的可能性，我们在BK基因敲除小鼠(Kcnma1-/-)培养的海马神经元上做了相同的实验，我们没有检测到paxilline对bicuculine诱导的细胞核钙信号改变有任何影响，也没有检测到paxilline对bicuculine引起的CREB磷酸化产生抑制作用(P=0.623)，这些结果表明paxilline的作用是特异性作用于BK离子通道的。　　为了探讨核膜BK通道是否参与对调节细胞核内钙信号依赖的基因表达的调节，我们选取了一系列对细胞核钙信号敏感的基因作为检测指标。所有神经元用IbTx预处理以排除细胞质膜BK通道的影响后，一部分用paxilline阻断核膜BK通道，另一部分作为对照，然后通过qPCR检测这些基因的mRNA水平，观察它们的表达是否受影响，以判断核膜BK通道是否有可能参与调节细胞核钙信号敏感的基因表达。在基础神经活动水平下，paxilline确实能够增强Fos(P=0.005),Npas4(P=0.000),Atf3(P=0.000),Btg2(P=0.007),Bcl6(P=0.000)，以及Ifi206b(P=0.005)等一些神经活动依赖性基因的表达。Paxilline对神经元基因表达的促进的作用可以被CaMKⅣ信号通路特异性阻断剂STO-609彻底阻断(Fos，P=0.001;Npas4，P=0.001;Atf3，P=0.001;Btg2，P=0.048; Bcl6，P=0.003; Ifi206b，P=0.015)。为了更进一步验证核膜BK通道对基因表达的作用，排除paxilline可能存在的非特异性影响，我们同样在Kcnma-/-小鼠的神经元上检测了paxilline是否还能够引起这些活动依赖性基因的表达。我们的实验结果显示在没有BK通道的神经元，paxilline不能引起这些基因表达的改变(Fos，P=0.896; Npas4，P=0.990; Atf3，P=0.896; Btg2，P=0.856;Bcl6，P=0.929; Ifi206b，P=0.929)，排除了paxilline非特异性的可能。　　综合这些结果，我们认为在神经元兴奋-转录偶联过程中，核膜BK通道对神经活动引起的核钙信号活动、CREB转录因子的激活，以及下游敏感基因的表达都具有重要的调控作用。　　3.核膜BK通道通过CaMKⅣ依赖性的核钙信号通路和CREB介导的基因表达，调节神经元树突分支。　　为了阐明核膜BK通道是否通过调控其下游基因的表达来调节树突分支，我们首先在核膜BK通道调控的基因中筛选了可能参与调节树突分支的基因。我们分别设计了一系列shRNA来干扰Fos，Npas4，Atf3，Btg2，Bcl6，以及Ifi206b这些核膜BK通道的下游基因的表达，并通过sholl分析方法检测神经元树突分支的复杂程度，检测树突总长度。我们的数据表明，在这六个下游基因当中，抑制Fos，Atf3，Btg2，Bcl6，以及Ifi206b的表达都没有影响树突分支复杂程度或者总长度，而当Npas4基因的表达被干扰，树突分支的复杂程度显著降低，树突总长度也下降(P=0.008)。这提示在核膜BK通道调控的下游基因中，Npas4可能介导了核膜BK通道对树突分支的影响。为了进一步证明核膜BK通道是通过Npas4来调节神经元的树突分支的，我们给培养神经元用IbTx预处理后，给予paxilline抑制核膜BK通道，并用上述shRNA干扰Fos，Npas4，Atf3，Btg2，Bcl6，以及Ifi206b的表达，我们发现只有当Npas4基因的表达被抑制，paxilline诱导的树突分支的复杂程度及树突总长的的增加被逆转(P=0.000)，而干扰其他基因表达均没有对paxilline的作用产生影响。这些结果说明，核膜BK通道是通过抑制Npas4基因的表达来调节神经元的树突分支的。　　上述结果表明，核膜BK通道的一个生理功能是将神经元的突触活动与细胞核钙信号耦联起来，进而调节突触信号从神经元树突向细胞核内的传递过程。我们的研究揭示核膜BK通道是细胞核膜上调节神经活动依赖性核钙信号的一个新的调节因子。　　以上实验数据用(X)±SD进行描述，统计分析采用独立样本t检验及One-wayANOVA，实验数据分为两个组的采用了独立样本t检验，实验数据分为三个组或更多的采用了One-way ANOVA，在One-way ANOVA的两两比较中，方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnetts T3检验，P＜0.05被认为具差异有统计学意义。