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目的：本课题组前期研究证明,Toll样受体4(TLR4)及相关分子-髓样分化因子88(MyD88)、髓样分化蛋白-2(MD-2)参与抗β2糖蛋白Ⅰ抗体／β2糖蛋白Ⅰ(anti-β2GPI／β2GPI)复合物诱导人单核细胞株THP-1表达组织因子(TF),且部分依赖膜联蛋白Ⅱ(ANX2),成为抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的机制之一。白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases,IRAKs)是TLRs下游关键信号分子,在天然免疫、获得免疫和一些疾病的发生发展中发挥重要作用。本论文重点探讨IRAKs在anti-β2GPI／β2GPI诱导单核细胞株THP-1细胞表达TF中的作用及其信号转导机制。
方法：①利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF mRNA的表达,采用试剂盒检测细胞TF活性。②采用RT-qPCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导THP-1细胞IRAK1、IRAK3、IRAK4的表达及IRAK1的磷酸化。③采用IRAK1／4抑制物预处理THP-1细胞,观察其对anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导IRAK1、IRAK3、IRAK4和TF的表达及IRAK1磷酸化的干预效应。④利用ANX2 RNA干扰慢病毒(LV-RNAi-ANX2)感染THP-1细胞,验证内源干扰效率,建立ANX2 RNAi细胞模型。⑤采用RT-qPCR及Western蛋白印迹检测anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激ANX2 RNAi的THP-1细胞IRAK1、IRAK3和IRAK4的表达及IRAK1的磷酸化情况。⑥采用TLR4／MD2途径抑制物-紫杉醇预处理THP—1细胞,观察其对anti-β2GPI／β2GPI复合物诱导IRAK1、IRAK3和IRAK4的表达及IRAK1磷酸化的影响。
结果：⑴Anti-β2GPI／β2GPI复合物(100μg／ml)能显著增加THP-1细胞TF mRNA水平及TF活性(与未刺激对照比较p<0.05)。⑵Anti-β2GPI／β2GPI复合物(100μg／ml)明显上调THP-1细胞IRAK1、IRAK3和IRAK4表达及IRAK1磷酸化水平(与未刺激对照比较p<0.05)。⑶IRAK1／4抑制物(50μmol／L)对anti—β2GPI／β2GPI复合物诱导的IRAK1和IRAK4表达没有影响,但能够降低IRAK3的表达及IRAK1的磷酸化水平,并且抑制TF的表达(与未经IRAK1／4抑制物处理组比较p<0.05)。⑷LV-RNAi-ANX2慢病毒感染THP-1细胞的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100,病毒感染THP-1细胞72 h后,ANX2的表达被沉默。⑸Anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激ANX2沉默的THP-1细胞,IRAK1、IRAK3和IRAK4的表达及IRAK1的磷酸化明显减弱(与未经病毒处理组比较p<0.05)。⑹紫杉醇(1μmol／L)能够抑制anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激THP-1细胞IRAK1、IRAK3和IRAK4表达及IRAK1的磷酸化(与未经紫杉醇处理组比较p<0.05)。
结论：①单核细胞株THP-1经anti-β2GPI／β2GPI复合物刺激后,细胞内信号分子IRAK1及IRAK4被诱导表达并致IRAK1磷酸化,最终促进细胞表达TF,可能是APS血栓形成的重要分子机制之一。②在上述过程中,IRAK3也被诱导表达,主要发挥对IRAK1及IRAK4的自身负反馈调节作用。③IRAK1／4抑制物能够降低anti-β2GPI／β2GPI诱导的THP-1细胞内IRAK1的磷酸化水平,同时抑制细胞TF的表达。这为APS血栓形成的预防及治疗提供新思路。④在anti-β2GPI／β2GPI诱导THP-1细胞表达TF所涉及的信号转导通路中,IRAKs作为关键分子而发挥作用,且与细胞表面受体ANX2及TLR4／MD-2紧密关联。