研究背景腹泻病是一种儿童常见病,据世界卫生组织统计,感染性腹泻是引起婴幼儿死亡的前三因素之一,每年大约有50万儿童死于腹泻及腹泻相关疾病。导致腹泻病的病原体包括病毒、细菌、寄生虫等。随着抗生素的应用以及人们对生活卫生的重视,由细菌引起的腹泻得到控制,病毒性腹泻已经成为腹泻病最常见的类型。随着分子检测技术的发展和改进,多种病毒在腹泻病人已被检出,如人轮状病毒(Human Rotavirus,HRV)、杯状病毒(Human Calicivirus,HuCV)、腺病毒(Human adenoviruses,AdV)、星状病毒(Human astrovirus,AstV)、人类博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)、人双埃可病毒(Human parechovirus, HPeV)等,这些已被检出的病毒中,有些已经被确认是导致腹泻病的重要病原体,但有些病毒(如HPeV)与腹泻病的关系正在研究中。在腹泻病毒中,引起腹泻最常见的病毒是轮状病毒与人杯状病毒,其中A群轮状病毒可引起重症腹泻,是目前预防工作的重点；人杯状病毒可引起暴发与流行,常导致公共卫生事件,其感染率仅次于A群轮状病毒；腺病毒也可引起腹泻,逐渐在国内外受到重视；星状病毒检出率较低,但问题也日益突出；有研究发现人类博卡病毒是继轮状病毒和杯状病毒之后导致腹泻的重要病毒。人双埃可病毒(Human parechovirus,HPeV)属于小RNA病毒科(Picomavi ridae),双埃可病毒属(Parehovirus)的一种无囊膜、无纤突的单股正链RNA病毒,基因组包含7300个核苷酸,在5’端到3’端都有一个非翻译区(UTR),有3个结构蛋白(VP1-VP3)和7个非结构蛋白(2A-2C和3A-3D)。HPeV引起的临床症状与感染其它肠道病毒的症状类似,主要为胃肠道、呼吸道等症状,但也会引起脑膜炎、脓毒症、肌炎及弛缓性麻痹等严重症状。1956年,HPeV首次从一名腹泻患儿粪便中检出,其后陆续在世界多国家(韩国、意大利、巴基斯坦等国家)腹泻患儿粪便中检出,并且检出率较高。在国内,HPeV在腹泻患者中的流行病学研究较少,仅兰州、上海、吉林、广州、香港、台湾开展过急性腹泻儿童人双埃可病毒的分子流行病学调查。近几年有报道称,由于缺乏健康人群中HPeV携带率调查资料作为对照,HPeV与腹泻病的关系尚还不清楚。在世界范围内,我国婴幼儿出生率高,居世界第二。感染性腹泻是婴幼儿常见病,其并发症严重,甚至可以导致死亡,因此应进行长期监测。尤其是病毒性腹泻传染性强,扩散范围大,发病急,更应受到重视。本研究主要开展HPeV与腹泻关系研究,了解HPeV在人群中流行病学特点和临床特征,分析在腹泻中病原学作用,探讨HPeV与腹泻的关系,及探讨健康人群、腹泻患者中HPeV阳性样本序列间进化关系。除此之外还监测常见腹泻病毒HRV、NoV、SaV、AdV、 AstV和HBoV,了解广州地区腹泻患者中病毒流行特点及流行毒株,为预防腹泻提供重要数据支持。研究目的1比较健康人群、腹泻患者中HPeV的感染率,丰富HPeV在腹泻、健康人群中流行病学资料,探讨HPeV与腹泻的关系。2了解在腹泻患者和健康人群中检出的HPeV的进化关系。3了解广州地区2013-2014年腹泻患者常见病毒HRV、NoV、SaV、AdV和AstV流行病学特点,丰富病毒性腹泻相关资料与数据,为我国病毒性腹泻提供分子生物学和流行病学新资料。研究方法1标本收集：以南方医科大学第三附属医院和某社区幼儿园为监测点,按监测方案要求采集腹泻病例粪便标本及健康人群粪便标本。2013年7月至2014年12月共收集腹泻患者粪便标本436份及健康人群粪便标本206份,同时使用自编问卷收集腹泻患者的人口学资料(包括性别,年龄等),和临床表现资料(如腹泻天数、发热、呕吐等)。2病毒检测：检测A组轮状病毒,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹泻患儿粪便标本中轮状病毒。从腹泻患者粪便标本中提取病毒DNA和RNA,从健康人群中提取粪便标本病毒RNA；再采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reactio,, PCR)和反转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptase-PCR,RT-PCR)方法扩增HuCV、AstV、AdV;采用巢式PCR扩增HBoV病毒；通过逆转录一巢式PCR扩增HPeV病毒,并对PCR扩增阳性标本产物进行测序,将返回序列进行BLAST比对,在GenBank上寻找同源序列,再用Bioedit、ClustalW、MEGA5.0进行序列与基因型别分析、再进行多序列对比分析、构建系统进化树,判断流行病毒优势株。3统计分析：数据录入用Epidata3.1进行双份录入,用SPSS 20.0软件进行数据分析,检验水准α=0.05。研究结果1研究对象基本情况①腹泻患者基本情况：本研究按腹泻诊断标准(按WHO腹泻标准：粪便水分及大便次数异常增加,通常指24 h内3次以上)共收集腹泻患者粪便标本436份,其中男性226例,女性210例,性别比为1.07：1；最大年龄89岁,最小年龄的为0.1岁,年龄平均为22.7+3.4岁,其中在2岁以下儿童所占比例最高,约占45.39%。患者性别在年龄分布差异无统计学意义(t=1.744,P=0.082)。②健康组情况：按纳入标准的粪便标准206份,其中男107例,女99例,男女性别比为1.1：1,年龄最大65岁,最小3岁,平均年龄26.4±4.2岁,性别在年龄分布差异无统计意义(t=1.249,P=0.213)。③腹泻组与健康组均衡性分析：腹泻组与健康组在性别、年龄差别无统计学意义(P分别为0.980、0.101)。2腹泻患者中常见病毒病原①436份腹泻患者粪便标本中,7种病毒检出率从高到低分别是HRV(11.69%, 51/436)、HPeV(11.69%,51/436)、AdV(9.86%,43/436)、HBoV(6.88%, 30/436)、SaV(1.15%,5/436)、AstV(0.46%,2/436).②常见病毒的人群分析：三个年龄组：0-2岁、2-7岁、7岁以上；0-2岁年龄组中,主要感染的病毒有HRV(13.7%)、HBoV(6.7%);2-7岁年龄组主要感染病毒有HPeV(13.3%)、SaV(6.7%)、AstV(4.4%)、AdV(13.3%);7岁以上年龄组主要感染的病毒有NOV(8.4%)。时间分布：9-12月份是多种病毒流行的月份,在5月份达到低谷。HRV、HPeV、AdV、HBoV在8-12月份呈上升趋势。HRV几乎全年均有检出,但在9-11月份检出率最高；HPeV主要在8-10月份流行,10月份检出率最高；NOV病毒11-12月检出率最高,但在3月份有一个小高峰；HBoV在7-10月检出率最高；AdV在7-12月份呈上升趋势。③ NOV、AdV、HPeV基因型别：NOV基因型：24株NOV阳性株,根据序列分析,分成7种基因型,主要包括在广州地区首次检出的GⅡ.P16(1株,4.17%)、罕见型GⅡ.P17(2株,8.33%)、常见基因型GⅡ.Pe(15株,62.50%)、GⅠ.P2(2株,8.33%)、GⅡ.P7(1株,4.17%)、GⅡ.P8(1株,4.17%,1/24)、GⅡ.Pg(2株,8.33%)。AdV基因型：43株AdV阳性株,分成5种型别,肠道病毒AdV41型(40株,93.02%)与AdV31型(1株,2.33%)；非肠道病毒包括AdV16型(1株,2.33%)、AdV1型(1株,2.33%)、AdV7型(1株,2.33%)、AdV2(1株,2.33%)。HBoV基因型：30株HBoV阳性株,共分成2种型别,HBoV1(24株,80.00%),HBoV2(6株,20.00%)。HPeV基因型：51株HPeV阳性株,分成5种型别,HPeV1A(12株,23.53%)、HPeV1B(26株,50.98%)、HPeV3(1株,1.96%)、HPeV(3株,5.88%)、HPeV 14(2株,3.92%)。④不同类型病毒感染者的临床症状：比较7种病毒、合并其它病毒感染的腹泻患者临床症状,发热率、呕吐率、腹泻次数,经统计学分析,差别无统计学意义(P=0.071,0.143,0.261)。将腹泻患者根据病毒感染情况分成未检出病毒、单一感染腹泻病毒、单一感染合并HPeV感染、单一感染不合并HPeV感染四组,比较临床症状(呕吐、发热、每日腹泻次数),经统计学分析后,仅呕吐率差别有统计学意义(P=0.022),即合并HPeV感染的组呕吐率(40.00%)较其它组高。3人双埃可病毒与腹泻关系的研究(1) ① HPeV与腹泻关系分析：腹泻组、健康组检出率分别为11.69(51/436)、2.91%(6/206),两组检出率经卡方检验,差别有统计学意义(χ2=13.345,P<0.001),提示腹泻组HPeV检出率较健康组高。OR值为4.548,95%的OR值的可信区间为1.191 9～10.776,提示HPeV与腹泻有关联。②在不同年龄组、性别中HPeV感染分析：将腹泻组、健康组分别分成不同的年龄组(7岁以下、7岁以上),不同的性别(男、女)。在7岁以下年龄组,腹泻组及对照组检出率分别15.8%(48/304)、2.40%(2/83),经卡方分析,差别有统计学意义(χ2=8.250,P=0.004),OR值为7.594,95%的可信区间(1.086～31.935),提示年龄与HPeV感染有关系。在男性中,腹泻组、健康组HPeV检出率分别为11.50%,1.87%,经卡方分析,差别有统计学意义(χ2=8.754,P=-0.003),OR值为8.754,95%的可信区间(1.589～29.314),提示男性可能与HPeV感染有关联。总OR值4.124较分层前4.416小。(2)排除其他病毒感染后HPeV感染分析：①共收集腹泻患者76名,对照组206名健康人群,HPeV检出率分别为10.53%(8/76)、2.91%(6/206),两组检出率经卡方检验,差别有统计学意义(χ2=6.821,P=0.009),OR为3.92,95%可信区间(1.314,11.707),说明HPeV与腹泻存在关联关系,提示HPeV是腹泻的一个危险因素。在7岁以下年龄组,腹泻组、对照组检出率分别16.67%(3/18)、2.40%(2/83),经卡方分析,差别有统计学意义(P=0.004),OR值为7.594,95%的可信区间(1.173～49.163),提示年龄与HPeV感染有关系。在女性中,腹泻组、健康组HPeV检出率分别为15.63%,4.04%,经卡方分析,差别有统计学意义(P=0.039),OR值为4.398,95%的可信区间(1.104～17.526),总OR值3.922与分层前一样。②HPeV流行情况及临床症状分析：在腹泻组(已排除其它病毒感染)共76例腹泻病人,检出率为10.53%(8/76),在7、8、9月份中检出,检出率分别是20.00%(2/10)、33.33%(3/9)、50.00%(3/6),9月份为高峰,而在1-6月份,10-12月都没有检出。76例腹泻病人根据有无感染HPeV分成两组,HPeV感染有8例,未感染HPeV有68例,比较其临床症状,两组发热率,经卡方检验,差别有统计学意义(P=0.043),提示两组发热率有差别,感染HPeV组较未感染HPeV组高。呕吐率、每日腹泻次数经统计学分析,差别无统计学意义(P分别为0.423、0.07)。4人群(腹泻患者、健康人群)HPeV阳性株序列分析、及各基因型流行特点①57株HPeV阳性株序列进化关系分析：57株HPeV阳性株(51株腹泻患者、6株健康人群)与参考序列构建核苷酸序列、氨基酸序列构建系统进化树分析,主要有HPeV1A、HPeV1B、HPeV3、HPeV4、HPeV14等型别被检出。而健康人群HPeV阳性株均为HPeV1B。HPeV1A主要与国内参考株、Harris在同一分支；HPeV1B、HPeV3、HPeV4、HPeV14与多国家、国内多地区在同一分支；值得探讨的是GZ-141481在氨基酸序列构建进化树中,在一个独立的分支,计算GZ-141481与HPeV1-16种型别的核酸、氨基酸成对距离,发现GZ-141481与参考序列核酸序列值为0.094-0.69,氨基酸序列值为0.484-1.000,故GZ-141481很可能是一株重组株或变异株,或者是一个新基因型。②腹泻患者中HPeV各型别流行情况：将436份腹泻粪便标本按年龄段分层3组,0-2岁、2-7岁、7岁以上；在0-2岁这个年龄组,HPeV五种型别HPeV1A (3.05%,6/197)、HPeV1B(7.11%,14/197)、HPeV3(0.51%,1/197)、HPeV4 (1.02%,2/197)、HPeV14(1.02%,2/197)均有检出；2-7岁年龄组只有HPeV1A (5.04%,6/119)、HPeV1B(5.04%,6/119)、HPeV4(0.84%,1/119)、HPeV14 (0.84%,1/119)有检出；7岁以上仅有HPeV1B(10.0%,12/120)有检出。③健康人群中HPeV各型别流行情况：健康人群中HPeV基因型全部为HPeV1B,将年龄分成3组,0-2岁、2-7岁、7岁以上；0-2岁,2-7岁年龄组检出率分别为10.00%(2/20)、6.35%(4/63)；在7岁以上未检出。④比较腹泻患者(已排除其它病毒感染)中HPeV1A、HPeV1B的临床症状：HPeV1A、HPeV1B分别可导致发热(58.33%；15.63%)、呕吐(33.33%；18.75%)、腹泻(每日腹泻次数：4.2+2.37；5.1±2.53)；HPeV1A主要导致发热,HPeV1A发热率高达58.33%,。HPeV1A发热率高于HPeV1B发热率(P=0.014),而呕吐率、每日腹泻次数经统计学分析,差别无统计学意义。研究结论1腹泻患者中HRV仍然是主要病毒,但HPeV检出率也较其它5种病毒高,应值得重视。7种病毒(HRV、NOV、SaV、AstV、AdV、HBoV、HPeV)流行的季节主要在秋冬季,易感人群主要是0-7岁年龄组。2 NOV病毒主要流行毒株是GⅡ.4/GⅡ.Pe,比往年不一样的是,此次监测中发现了较少见的GⅡ.P17、GⅡ.P16型；其中GⅡ.P16型在广州地区首次检出。3 HPeV与腹泻有关联,很可能是腹泻的一个危险因素,很可能加重腹泻的临床症状,7岁以下年龄段可能是一个易感人群。4 HPeV1B进化关系较HPeV1A复杂,可能更容易变异或者重组,应引起重视。除此之外,HPeV3、HPeV4、HPeV14型祖先均来自国外分别为GQ183026-32(N etherlands)、DQ315670(Netherlands)、GU946796(Thailand),国内对其可能没有免疫力。但应引起重视的是,HPeV1A可能加重腹泻的临床症状,GZ-141481有可能是一株变异株或重组株,或是新的基因型,有待进一步研究。