目的:通过建立硫酸镍（NiSO₄）体外处理的大鼠睾丸间质（Leydig）细胞类固醇合成障碍模型,筛选显著性差异表达的长链非编码RNAs（lncRNAs）、微小RNA（miRNAs）以及mRNAs并验证,构建竞争性内源性RNA（ceRNA）调控网络并检测PI3K/Akt信号通路相关基因和蛋白的表达,探讨其在镍致大鼠Leydig细胞类固醇合成障碍中的作用机制。方法:（1）摘取大鼠睾丸,采用0.25%IV型胶原酶消化、Percoll密度梯度（5%、30%、58%和70%）离心法和体外差速贴壁培养得到纯化的Leydig细胞。（2）使用不同浓度NiSO₄（0、250、500和1000μmol/L）处理处于对数生长期的Leydig细胞24 h,于倒置相差显微镜下观察细胞形态的改变。（3）采用MTT法对Leydig细胞存活率进行测定。（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测在1 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）存在下不同浓度NiSO₄（0、250、500和1000μmol/L）处理24 h的Leydig细胞培养液中睾酮含量。（5）蛋白免疫印迹法（Western Blot）用于检测细胞中类固醇合成快速调节蛋白（StAR）和细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）蛋白表达水平。（6）大鼠Leydig细胞经0和1000μmol/L NiSO₄处理24 h后,采用高通量测序技术检测差异表达的lncRNAs、miRNAs以及mRNAs,并对显著性差异mRNAs进行聚类分析。（7）基于基因本体学（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对差异表达mRNAs进行功能注释和通路分析。（8）筛选出与类固醇合成有关的mRNAs,使用miRanda和PITA数据库预测与mRNAs具有负靶关系的miRNAs,以及与miRNAs具有负靶关系的lncRNAs,构建ceRNA网络。（9）使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证随机选择的18个差异RNAs的表达水平,以及ceRNA网络参与基因在不同浓度NiSO₄（0、250、500和1000μmol/L）处理下的剂量依赖关系。（10）使用RT-qPCR法和Western Blot法分别检测各浓度NiSO₄处理下大鼠Leydig细胞Pik3r1、Akt1 mRNA和PI3K/Akt相关蛋白的表达水平。结果:（1）Leydig细胞在含有不同浓度NiSO₄的培养液中处理24 h后,倒置显微镜下可见,1000μmol/L NiSO₄组细胞的胞浆中相比于对照组产生大量且明显的空泡。MTT结果显示:随着NiSO₄浓度的增加,各处理组细胞存活率逐渐降低（P<0.05）。（2）ELISA检测结果表明:和对照组相比,各处理组Leydig细胞培养上清液里睾酮水平随NiSO₄剂量的增加而减少（P<0.05）。Western Blot法检测发现:和对照组比较,随着NiSO₄浓度的增加,各处理组类固醇生成酶StAR和CYP11A1的蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）。（3）测序结果显示:共有372个lncRNAs（FC>2,P<0.05）,27个miRNAs（FC>2,P<0.05）以及3666个mRNA（FC>2,P<0.01,FDR<0.01）的表达在NiSO₄的影响下被显著改变。GO和KEGG富集分析结果显示:与类固醇相关的功能和信号通路被显著富集（如MAPKs、PI3K/Akt信号通路等）。靶基因预测结果显示:与类固醇有关的15个mRNAs由16个miRNAs负靶向调控,这些miRNAs与75个lncRNAs具有负靶向作用关系,可构建ceRNA网络。（4）RT-qPCR结果显示:在18个被检测的RNAs中,有15个RNAs的表达与测序结果相符。验证了4条ceRNA网络,即LOC102549726/miR-760-3p/Atf6、LOC102549726/miR-760-3p/Ets1、LOC102549726/miR-760-3p/Sik和AABR07037489.1/miR-708-5p/Mapk14。验证剂量依赖关系的RT-qPCR检测结果显示:除Mapk14外,4条ceRNA网络参与基因的表达水平均随NiSO₄浓度的增加呈现剂量依赖趋势,且与测序和RT-qPCR验证的表达趋势一致。（5）RT-qPCR结果显示:与对照组比较,随着NiSO₄浓度的增加,各处理组Pik3r1表达逐渐升高（P<0.05）,500和1000μmol/L NiSO₄组中Akt1 mRNA表达逐渐降低（P<0.05）。通过Western Blot法检测发现:各处理组PI3K和Akt总蛋白表达量无显著性差异（P>0.05）;而随着NiSO₄浓度的增加,250、500和1000μmol/L NiSO₄组磷酸化蛋白p-PI3K p85表达水平有降低趋势,差异无统计学意义（P>0.05）;1000μmol/L NiSO₄组p-Akt的表达显著降低（P<0.05）;随着NiSO₄剂量的升高,各处理组中p-PI3K p85/PI3K p85以及高浓度组p-Akt/Akt蛋白比率均显著下降（P<0.05）。结论:（1）非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）能够通过ceRNA网络机制（LOC102549726/miR-760-3p/Atf6、LOC102549726/miR-760-3p/Ets1、LOC102549726/miR-760-3p/Sik1和AABR07037489.1/miR-708-5p/Mapk14）参与调控镍诱导的大鼠Leydig细胞类固醇生成障碍。（2）镍可抑制大鼠Leydig细胞PI3K/Akt信号通路的激活,可能因此影响睾酮生成。