研究背景心肌长时间缺血可以导致组织损伤以及细胞死亡,冠状动脉再通是缓解缺血损伤的关键,但较长时间缺血后的再灌注却可导致更为严重的损伤,即心脏缺血／再灌注损伤(Ischemia and reperfusion Injury, I/R), I/R的概念于1960年被Jennings等第一次提出。I／R是冠脉再通术(溶栓、PTCA或搭桥术)后的重要的并发症。如何做到既保证尽早恢复缺血组织的血流灌注,又减轻甚至消除再灌注损伤的发生便成为缺血性心脏病防治中的重要课题。有效防治再灌注损伤的重要前提是阐明其发病机制。心肌在遭受一次或多次反复的短暂缺血再灌注后,会表达出一种对随后而来的一次长时间的严重缺血损伤的抵抗能力的提高,这种现象称为缺血预适应(ischemic preconditioning, IPC), IPC于1986年首次被Murry等发现。经过预适应的心肌能够缩小心肌梗死的面积,改善心肌收缩力,保护冠状动脉内皮和心肌细胞的超微结构,保护微循环,降低再灌注导致的心律失常的发生率,更快地使心肌从再灌注诱导的心肌顿抑中恢复,是一种内源性自我保护方式。Rho-kinase是一类丝-苏氨酸蛋白家族,可作为小G蛋白RhoA的直接下游效应物,参与多种细胞生物功能,如：平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架组装、细胞黏附、移动、基因表达等。Rho-kinase以两种同源性极高的异构体形式存在：ROCK-1(或ROKβ、p160ROCK)和ROCK-2(或ROKα)。ROCK-1位于18号染色体,含有1354个氨基酸,ROCK-2位于12号染色体,含有1388个氨基酸。二者有65%的同源性,而在激酶结构域则有92%的同源性。Y-27632和fasudil是ROCK的选择性抑制剂,作用于其ATP依赖激酶区,可同时抑制ROCK-1和ROCK-2。Rho-kinase可以介导下游一系列磷酸化／脱磷酸化反应,已有20多种下游蛋白被发现。如：MLC、MYPT-1 ERM、PTEN、IRS1 NHE1、LIM激酶等。最具特征意义的Rho-kinase底物是MLC (myosin light chain)和MYPT-1 (myosin binding subunit of MLC phosphorylation, MLC磷酸酶的肌球蛋白结合亚基)。Rho-kinase可以通过作用于MLC或MYPT1来增加胞浆内MLC的磷酸化,促进肌动蛋白微丝骨架的聚合。最近研究发现,Rho-kinase参与了变异性心绞痛、心衰、心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病。初步研究表明Rho-kinase在心脏I／R损伤中活性增加,而在IPC中活性可能降低,但是其中发生机制却远未清楚。例如Rho-kinase调控哪些细胞因子,通过哪些信号途径发挥作用,以及在IPC中Rho-kinase活性是否会降低,Rho-kinase活性降低的机制如何,这些问题构成了本研究课题的内容。在本研究中,我们拟建立大鼠I／R和IPC模型,明确Rho-kinase活性在IPC和I／R中是否不同,Rho-kinase对心肌梗死面积、心肌细胞凋亡的影响以及对细胞凋亡有关信号通路的调节；明确IPC中ERK-MAPK是否能通过下调Rho-kinase活性起到抗心肌细胞凋亡作用。通过以上研究,进一步明确Rho-kinase在心脏I/R和IPC中所起的作用及其机制。这对于阐明I／R和IPC的发病机制,为心肌保护提供新的治疗途径具有重要的意义。本研究共分三部分进行：第一部分Rho-kinase在心脏缺血再灌注损伤和心肌缺血预适应中的表达及其对细胞凋亡的影响；第二部分心脏缺血再灌注损伤中Rho-kinase对AIF的影响及调节机制；第三部分心肌缺血预适应中ERK对Rho-kinase的调节。第一部分Rho-kinase在心脏缺血再灌注损伤和心肌缺血预适应中的表达及其对细胞凋亡的影响研究目的本部分研究拟建立大鼠I／R和IPC模型,应用药物fasudil抑制Rho-kinase活性,测定心肌梗死面积、心肌细胞的凋亡,明确Rho-kinase在心脏I／R和IPC中的作用。研究方法1.大鼠心脏I／R和IPC模型的建立和分组：采用开胸结扎和松开冠状动脉的方法建立大鼠心脏I／R和IPC型。分为以下四组：对照组(18只)、I／R组(18只)、I/R+fasudil组(18只)和IPC组(18只)2. Rho-kinase活性的检测：Rho-kinase的活性通过Western检测其特异性底物MYPT-1的磷酸化水平来表示。3.心肌梗死面积检测：采用伊文思蓝染色鉴别非缺血区与缺血危险区(AAR),硝基四氮唑蓝(NBT)染色鉴别梗死心肌与非梗死心肌。以称重法计算心肌缺血危险区(伊文思蓝未染区),梗死区(NBT未染区)的重量,心肌梗死范围的大小以梗死区重量占缺血危险区重量的百分比表示。公式为：心肌梗死范围=NBT未染区／伊文思蓝未染区×100%4.大鼠心肌细胞凋亡的检测：采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术(TUNEL)试剂盒检测各组大鼠心肌细胞的凋亡。按照试剂盒说明书操作。标记前用DNA酶处理切片做阳性对照,用标记液代替TdT酶反应液做阴性对照。每张切片随机选取10个视野(×400倍),计数凋亡细胞个数和所有细胞个数,以凋亡细胞个数／所有细胞个数反映各组心肌细胞凋亡的情况。5. Caspase-3活性的检测：Caspase-3的活性通过Western检测其裂解产物cleaved-Caspase-3的表达水平来表示。研究结果1.p-MYPT-1(磷酸化的MYPT-1)在I／R中大量表达,而在IPC中活性降低。在I／R中应用Rho-kinase抑制剂fasudil后,p-MYPT-1表达降低：对照组中只有微弱的p-MYPT-1表达。说明Rho-kinase在I／R中活性增加,而IPC和fasudil均抑制了Rho-kinase的活性。2. Rho-kinase活性的抑制可减少大鼠心肌梗死面积：I／R组大鼠的心肌梗死面积占危险区心肌面积的60.3±4.08%, I/R+fasudil组大鼠的,心肌梗死面积／AAR减少至38.62±2.66%,说明在I／R大鼠中抑制Rho-kinase活性后能显著减少心肌梗死面积。在IPC中大鼠的心肌梗死面积降至29.16±1.08%,说明IPC可能通过降低Rho-kinase活性而明显缩小心肌梗死面积。3. Rho-kinase活性的抑制可减少大鼠心肌细胞凋亡率：在对照组大鼠心肌中无TUNEL染色阳性细胞。在I／R组大鼠心肌中,TUNEL染色阳性细胞占全部细胞的33.87±1.57%,说明I／R可引起心肌细胞凋亡增加。在I/R+fasudil组大鼠心肌中,TUNEL染色阳性细胞占全部细胞的17.05±4.22%,说明在I／R大鼠中抑制Rho-kinase活性能减少心肌细胞凋亡率。在IPC中,细胞凋亡率为17.29±0.84%,说明IPC可能通过降低Rho-kinase活性而明显降低心肌细胞凋亡率。4. Rho-kinase活性的抑制降低Caspase-3活性：在I／R中cleaved-Caspase-3大量表达,在IPC和I/R+fasudil组中其表达分别减少了约65.3%和58.5%,说明IPC和fasudil在抑制Rho-kinase活性同时抑制了Caspase-3的活性。结论1.在大鼠心肌I/R损伤中Rho-kinase活性明显增加,加重了心脏的损伤、增加了心肌细胞凋亡。2.在大鼠心肌I/R损伤中抑制Rho-kinase活性后能减少心肌梗死面积和心肌细胞的凋亡率,减轻心肌细胞的损伤程度。3.IPC中Rho-kinase活性降低,心肌梗死面积和心肌细胞凋亡减轻,具有心脏保护作用。第二部分心脏缺血再灌注损伤中Rho-kinase对AIF的影响及调节机制研究目的探讨在大鼠心脏I／R中Rho-kinase对AIF的影响及调节机制。(Rho-kinase/JNK/AIF信号通路在心脏I／R损伤中的作用)研究方法1.大鼠心脏I／R损伤模型的建立,分为以下5组：对照组(18只)I/R+NS组(18只)、I/R+fasudil组(18只)、I/R+SP600125(JNK抑制剂)组(18只)和I/R+DMSO组(18只)。2.心肌梗死面积检测,计算梗死心肌面积占危险区(AAR)心肌面积百分比。3.TUNEL法检测细胞凋亡。4.采用Western Blot检测各组大鼠心肌中Rho-kinase、JNK、AIF的活性变化。Rho-kinase活性通过检测MYPT-1的磷酸化水平来表示,通过检测JNK的磷酸化蛋白的水平来反映JNK的活性,通过分别检测AIF的线粒体和细胞核中的蛋白水平来反映AIF的活性。研究结果1.心脏I／R损伤中Rho-kinase、JNK、AIF活性增加：与对照组相比,I/R+NS组中p-MYPT-1和p-JNK蛋白表达明显增加。I/R+NS组中AIF在细胞核中的表达增多,在线粒体中的表达减少,AIF从线粒体到细胞核的转位增加。说明心脏I／R损伤可增加Rho-kinase、JNK、AIF活性。2.抑制Rho-kinase或JNK后减少大鼠心肌梗死面积：I/R+NS组和I/R+DMSO组大鼠的心肌梗死面积分别占整个左心室面积的59.89±3.83%和61.64±3.3%,两者相比无显著性差异。I/R+fasudil组大鼠的心肌梗死面积／AAR减少至38.62±2.66%,说明在I／R中抑制Rho-kinase活性能显著减少心肌梗死面积。I/R+SP600125组大鼠的心肌梗死面积／AAR减少至41.1±2.57%,说明在I／R中抑制JNK活性能显著减少心肌梗死面积。3.抑制Rho-kinase或JNK后减少大鼠心肌细胞凋亡：I/R+NS组和I/R+DMSO组大鼠的心肌细胞凋亡分别为32.78±5.01%和34.45±3.73%,两者相比无显著性差异。I/R+fasudil组大鼠的心肌细胞凋亡减少至17.05±4.22%,说明在I／R中抑制Rho-kinase活性能显著减少心肌细胞凋亡。I/R+SP600125组大鼠的心肌细胞凋亡减少至16.25±3.29%,说明在I／R中抑制JNK活性能显著减少心肌细胞凋亡。4.抑制Rho-kinase活性可降低JNK活性：在I／R组大鼠心肌中磷酸化JNK表达增多,应用fasudil后磷酸化JNK的表达下降,说明磷酸化JNK的表达与Rho-kinase有关,JNK是Rho-kinase的下游分子。5.在I/R+DMSO组p-MYPT-1表达明显增加,应用JNK抑制剂SP600125后,p-MYPT-1表达无明显变化。说明p-MYPT-1的表达与JNK活性无关,进一步证实JNK是Rho-kinase的下游分子。6.抑制Rho-kinase活性可减少AIF从线粒体到心肌细胞核的转位：在I／R组大鼠心肌细胞核中AIF的表达增多,抑制Rho-kinase活性后其表达减少；另一方面,在I／R组大鼠心肌细胞线粒体中AIF的表达减少,而抑制Rho-kinase活性后其表达增多。说明抑制Rho-kinase活性可减少AIF从线粒体向细胞核的转移,证实AIF是Rho-kinase的下游分子。7.抑制JNK活性可减少AIF的从线粒体到心肌细胞核的转位：在I／R组大鼠心肌细胞核中AIF的表达增多,抑制JNK活性后其表达减少；另一方面,在I／R组大鼠心肌细胞线粒体中AIF的表达减少,而抑制JNK活性后其表达增多。说明抑制JNK可以减少AIF从线粒体向细胞核的转移,证实AIF是JNK的下游分子。结果证实,在大鼠I／R损伤模型中,Rho-kinase调节AIF从线粒体向细胞核的转移,在这个过程中,JNK起了重要的作用。Rho-kinase通过JNK来发挥调节AIF的作用。Rho-kinase/JNK/AIF信号通路是介导大鼠心脏I/R损伤的一条重要的通路。结论1.I／R损伤模型中,Rho-kinase调节AIF从线粒体向细胞核的转移,在这个过程中,JNK起了重要的作用。Rho-kinase通过JNK来发挥调节AIF的作用。2. Rho-kinase/JNK/AIF信号通路是介导心脏I／R损伤的一条重要的通路。第三部分心肌缺血预适应中ERK对Rho-kinase的调节研究目的探讨在心肌缺血预适应中ERK是否可通过下调Rho-kinase活性起到心肌保护作用。研究方法1.大鼠心脏I/R和IPC模型的建立,分为以下6组：I／R组(18只)IPC组(18只)、IPC+PD98059 (ERK抑制剂)组(18只)、IPC+fasudil组(18只)、IPC+PD98059+fasudil组(18只)和I/R+DMSO组(18只)。2.心肌梗死面积检测,计算梗塞心肌面积占危险区(AAR)心肌面积百分比。3. TUNEL检测细胞凋亡。4. Western Blot分别检测ERK. RhoA. Rho-kinase、ROCK1、ROCK2、Csapase-3活性变化。通过检测ERK1/2磷酸化蛋白的表达水平来检测其活性。RhoA被激活后转位至细胞膜,我们通过分别检测细胞膜和细胞浆的表达来反映RhoA活性。研究结果1.IPC降低心肌细胞凋亡、Caspase-3活性和心肌梗死面积：I／R组大鼠心肌细胞凋亡率为33.87±1.57%,IPC组大鼠的心肌细胞凋亡率降低至17.29±0.84%。与I／R组相比,IPC组Capsase-3 cleavage蛋白表达大约减少65%,Caspase-3活性明显降低。I／R组大鼠心肌梗死面积为60.53±4.08%,而在IPC组心肌梗死面积降至29.16±1.08%。IPC+DMSO组大鼠的心肌细胞凋亡率和心肌梗死面积分别为30.06±0.79%和18.46±0.92%,与IPC组相比二者无明显差异。结果表明IPC可明显降低大鼠心脏缺血再灌注损伤造成的心肌细胞凋亡和心肌梗死面积2.IPC对ERK1/2的作用：免疫组化检测到IPC组磷酸化的ERK1/2表达明显增加；Western Blot同样检测到IPC组ERK1/2的磷酸化大致增加了1.8倍。说明IPC可明显增加的ERK1/2的活性。3.IPC对RhoA、Rho-kinase、ROCK1、ROCK2的作用：RhoA蛋白的活性通过RhoA的膜转位来表示,I／R组与IPC组表达无明显差异。ROCK1蛋白表达在I／R组明显增加而在IPC组降低,ROCK1 mRNA表达水平在I／R组明显增加,而在IPC组降低。ROCK2表达在I／R组和IPC组均增加。Rho-kinase活性通过检测其特异性底物MYPT-1的磷酸化水平来表示,与I／R组相比,IPC组MYPT-1的磷酸化减低了49%。结果说明心肌IPC可明显降低大鼠I／R损伤造成的Rho-kinase活性和ROCK1表达增加,而对RhoA活性和ROCK2表达则无明显作用。4.IPC中抑制ERK1/2后增加心肌细胞凋亡、Caspase-3活性和心肌梗死面积：IPC+PD98059组大鼠心肌细胞凋亡率为29.83±0.7%,与IPC组相比明显增加；IPC+PD98059组的Capsase-3 cleavage蛋白表达大概增加2.1倍,Caspase-3活性明显增加(P<0.05 vs IPC组);IPC+PD98059组大鼠心肌梗死面积为44.88±0.7%,与IPC组相比明显增加。结果表明IPC中应用PD98059抑制.ERK1/2活性可明显增加I／R损伤造成的心肌细胞凋亡和心肌梗死面积。5.心肌IPC中ERK1/2抑制Rho-kinase活性：在IPC中,ERK1/2活性增加而Rho-kinase活性则明显降低。在IPC+PD98059组,MYPT-1的磷酸化水平和ROCK1蛋白表达水平均明显增加(P<0.05 vs IPC组),ROCK1 mRNA表达水平也明显增加。结果表明IPC中应用PD98059抑制ERK1/2可明显增加Rho-kinase活性和ROCK1表达。但是,IPC+fasudil组的ERK1/2磷酸化水平与IPC组相比,二者无明显差异；在IPC+PD98059组,ERK1/2磷酸化水平明显降低；而在IPC+PD98059+fasudil组ERK1/2磷酸化水平与IPC+PD98059组相比,二者无明显差异。结果说明应用Rho-kinase抑制剂后并不能改变ERK1/2的活性水平。6.心肌IPC中抑制Rho-kinase可对抗由ERK1/2抑制所致的心肌细胞凋亡增加：与IPC+PD98059组相比,IPC+PD98059+fasudil组心肌细胞凋亡减少了22%而Capsase-3活性水平降低了30%。心肌梗死面积减少了12%左右。我们的结果表明IPC中,抑制Rho-kinase活性可部分减少由ERK1/2活性抑制所致的心肌细胞凋亡,进一步说明IPC中,ERK1/2信号可以下调Rho-kinase活性,起到保护心肌的作用。结论1.心肌缺血预适应中,激活的ERK信号可以下调Rho-kinase,从而减少心肌梗死面积和心肌细胞的凋亡率,减轻心肌细胞的损伤程度,具有心脏保护作用。2.‘在此过程中RhoA并未参与,ERK主要通过下调ROCK1蛋白水平和基因水平来发挥作用。创新性及局限性1.创新点(1)提出并证实了Rho-kinase可通过Rho-kinase/JNK/AIF途径参与心肌缺血再灌注造成的心肌细胞凋亡。(2)提出并证实了心肌缺血预适应中ERK-MAPK信号通路可通过下调Rho-kinase活性降低细胞凋亡,并发现在此过程中RhoA并未参与,ERK主要通过下调ROCK1蛋白水平和基因水平来发挥作用。2.局限性(1)限于时间,本研究未能在细胞水平上研究细胞信号通路,这是本研究目前正在进行的内容。(2)由于时间及条件的限制,未能应用基因敲除和RNA干扰等技术在组织及细胞水平上研究。