灰树花(Grifolafrondosa.S.F.)，又名贝叶多孔菌、云蕈、栗子蘑、栗蘑、千佛菌、莲花菌、甜瓜板、奇果菌、叶奇果菌，是一种高档药食两用珍稀食用菌。大量研究表明，其子实体或菌丝体中的灰树花多糖具有显著的抗肿瘤、降血糖、抗肝炎、抗HIV病毒以及改善免疫系统功能等功效。灰树花多糖在所有抗肿瘤多糖中作用最强。虽然不断有结构新颖的多糖被报道，但由于研究者所用方法各异，是否含有其他结构特征的多糖并不明确。美国FDA已经批准了口服灰树花水提粗多糖(MD-fraction)用于治疗晚期乳腺癌和前列腺癌的Ⅱ期临床实验。此外，灰树花已被开发成多种保健品，其中包括我国的保力生胶囊和维吉尔胶囊、日本的MAIEXT以及美国的Grifron系列产品。这些研究及应用提示多糖在肠道可能被吸收而发挥作用。但至目前为止，植物多糖能否被口服吸收?吸收机制如何?是多糖领域研究的一大挑战。虽然多糖抗肿瘤活性时有报导，但多糖是通过靶向哪些功能性蛋白而发挥作用却鲜见报导。为了探索多糖的靶向性及其吸收机制，我们从灰树花中提取分离纯化得到6种均一多糖，并对这几种多糖进行结构解析和生物活性筛选，从中我们发现了两个具有很好的免疫激活和抗肿瘤活性的多糖。将其中一种活性多糖作为研究对象，我们进行多糖的吸收机制研究，同时运用石英晶体微天平(QCM)技术研究了多糖与靶蛋白之间的相互作用，并且利用靶蛋白对从自然界分离纯化得到的多糖进行筛选，找出有潜在活性的多糖。　　灰树花子实体依次经过热水和5％NaOH溶液提取，得到粗多糖GFP和碱提多糖GFPB。粗多糖GFP和GFPB分别用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析等方法反复分离纯化，得到六种水溶性均一多糖：GFPW、GFPW1-2、GFPW1-3、GFPW2、GFPBW1以及GFPBW2，其分子量分别为15.4kDa，16.2kDa，6.8kDa，15.5kDa，300kDa，20kDa。运用气相(GC)、红外(IR)、气质联用(GC-MS)、核磁共振(NMR)、质谱(ESI)、部分酸水解、乙酰解以及Smith降解等方法，对他们的理化性质以及一级结构进行了研究。结果表明，灰树花中除了含有大量的葡聚糖之外，我们还发现了一种结构新型的杂多糖GFPW。结构鉴定表明GFPW为一种的α-1，6-连接的半乳聚糖，每5个半乳糖糖残基在C-2位上连有两个支链，支链由岩藻糖和甘露糖以α-1，3.连接方式组成。GFPW2为-β-1，6-连接的葡聚糖，每3个葡萄糖残基在3位上有一个支链，且支链为两个中性己糖连接，由两种连接方式，一种是β-1，3-连接的葡聚糖组成，另一种是β-1，4-连接的葡聚糖。所含β-1，3-连接支链与β-1，4-连接的比例为3:2。GFPBW1为-β-1，3-连接的葡聚糖，每3个葡萄糖残基在6位上有一个支链，其支链为一末端连接的葡萄糖组成。GFPBW2也是β-1，3-连接的葡聚糖，结构较GFPBW1复杂，为一新型结构的葡聚糖，其主链上还存在β-1，4-连接。甲基化以及部分酸水解分析可知，该多糖没有很长的支链。主链为每6个β-1，3-葡萄糖残基，连有一个β-1，4-葡萄糖残基，并且在每6个β-1，3-葡萄糖残基的6位上连有两种支链，其中一种支链结构为由3个连接的β-1，6-葡萄糖残基组成，另一种为一个非还原末端，该葡聚糖结构也是首次从灰树花中提取分离得到。　　基于NF-KB的免疫激活活性实验，发现GFPBW1和GFPBW2具有很好的免疫调节作用。为了排除LPS引起的免疫激活，我们对这种多糖进行了内毒素去除实验，发现这两种多糖仍然具有很好的免疫激活活性。动物实验表明，这两种多糖都有很好的S-180瘤细胞的生长抑制活性。作用机制研究发现这两种β-1，3-葡聚糖通过与Dectin-1结合，从而引起一系列免疫激活效应。而磷酸化GFPW2能抑制U87人神经胶质瘤细胞的增长，抑制率可达43.73％。GFPW经过硫酸衍生化后发现，其硫酸化多糖Sul-GFPW能抑制HIMC-1细胞的增殖，同时在100μg/ml的浓度下，具有很好的抗血管生成活性。　　运用CNBr/NaOH方法荧光标记多糖，对GFPBW1多糖的吸收及其机制进行了研究。首先对荧光标记多糖的位置以及标记前后活性以及结构进行检测。确定了多糖的荧光标记位置主要在C-6位上。标记前后，多糖的主体结构和功能都没有发生明显变化。研究发现，GFPBW1能被Caco-2细胞透过，并且在10h内没有被降解，其吸收率大于70％。通过检测不同电性的多糖，我们发现，带有正电荷的多糖更容易被细胞吸收。同时，运用细胞免疫荧光检测发现，荧光标记的多糖可以被细胞内吞，并且不受荧光素的影响。大鼠口服实验表明，多糖GFPBW1在体内也可以被吸收，最快可12min内可在血中检出，口服利用度为73.91％。对大鼠血清进行处理，回收样品，经过HPLC分析发现，GFPBW1可以在血清中被检测到。对GFPBW1的吸收机制进行研究表明，人小肠上皮细胞HIMC上网格蛋白clathrin，其内吞相关蛋白Eps15，Rab5以及dynaminI能与多糖GFPBW1在细胞膜和胞浆内共聚。运用基因沉默及突变技术，我们发现，下调clathrin、dynaminI或突变Eps15，可明显降低多糖的内吞，表明网格蛋白Clathrin及其相关蛋白Eps15和dynaminI参与多糖的内吞。　　为了弄清楚多糖的作用靶点并且利用靶蛋白对多糖进行活性筛选，我们使用QCM进行了多糖与蛋白的相互作用实验。在细胞实验中，我们发现蜈蚣藻聚糖G19可以诱导U87细胞凋亡，运用biotin芯片技术，发现G19能与表皮生长因子EGF以及磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K结合。早期研究表明，硫酸化多糖α-1，4-葡聚糖WSS25可以与骨形成蛋白BMP2结合，通过Smad/Id1通路，发挥抗血管生成作用。运用不同连接方式的葡聚糖，不同分子量以及硫酸基取代度的多糖进行检测。我们发现α-1，4-glucan更有利于与BMP2结合，且分子量越大，硫酸基取代度越高，两者的结合能力越强。在25℃条件下硫酸化多糖比45℃条件下得到的硫酸化多糖与BMP2的结合能力要强。表明如果硫酸化取代度过高，使得6-OH的取代程度增加，将会影响硫酸化多糖与BMP2之间的作用。具有很好的免疫激活活性和抗肿瘤活性的β-1，3-葡聚糖GFPBW1和GFPBW2的靶分子研究表明，这两个葡聚糖能与Dectin-1结合，从而引起免疫功能激活。这是首次我们发现多糖GFPBW1，GFPBW2能与Dectin-1直接结合。　　综上所述，多糖能通过网格蛋白clathrin等相关蛋白介导而被人小肠细胞HIMC内吞进入浆胞，多糖GFPBW1能被大鼠口服吸收。多糖可以通过靶向EGF，PI3K，BMP2以及Dectin-1而分别发挥直接诱导肿瘤细胞凋亡、抗血管生成以及激活免疫功能而抗肿瘤的作用。这些研究为多糖吸收及其机理研究，以及多糖靶向性研究做出了探索性尝试，奠定了理论基础。