凋亡素基因转入人类肝癌细胞诱导细胞凋亡研究

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目的:本研究旨在探讨凋亡素基因表达对人类肝癌细胞的影响。 方法:将凋亡素基因连接到增强型绿荧光蛋白(EGFP)基因C末端的终止密码前,并使两者读框不移位,构建成pEGFP-VP3载体。通过核酸内切酶酶切分析及测序鉴定载体结构。用非脂质体脂质转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分别转染两组HepG2细胞,以使EGFP和EGFP-VP3(凋亡素-绿荧光蛋白融合蛋白)得到瞬时表达,同时设立未转染组进行空白对照。通过荧光显微镜观察EGFP和EGFP-VP3在HepG2中的定位、表达量及在细胞生长、凋亡过程中的动态变化,用Annexin V-藻红素(PE)检测细胞凋亡。 结果:EGFP均匀分布于细胞浆和细胞核,细胞形态无变化,细胞能分裂增殖,与未转染组对比细胞凋亡无增加。EGFP-VP3主要定位于HepG2细胞核,呈颗粒状,在六天观察期间,核内的EGFP-VP3颗粒逐渐凝集、变粗,细胞变小、变圆,最后成为无细胞结构和形态的颗粒。同时,转染pEGFP-VP3细胞凋亡明显增加,p值小于0.01,与其它两组比较有显著性差异。转染pEGFP-VP3的HepG2在48小时细胞凋亡率50%。少数转染细胞的EGFP-VP3没有向细胞核聚集、荧光较弱,用Annexin V-PE染色显示无细胞凋亡。 结论:(1)凋亡素基因连接到增强型绿荧光蛋白基因C末端,构建成pEGFP-VP3载体,可以表达凋亡素-增强型绿荧光蛋白融合蛋白;(2)在荧光显微镜下,通过EGFP-VP3可以显示调亡素在细胞中的表达定位、表达量及动态变化;(3)在肝癌细胞HepG2中,凋亡素主要定位于细胞核,呈颗粒状,并随细胞凋亡的过程而逐渐聚集,最后裂解成碎片;(4)凋亡素基因转染HepG2后能诱导该细胞凋亡,核定位是诱导HepG2细胞凋亡的必要条件;(5)凋亡素需达到一定量后才能诱导肝癌细胞HepG2凋亡。
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