第一部分:三阴性乳腺癌的临床研究进展三阴性乳腺癌是一种异质性疾病,很长一段时间以来缺乏特定的治疗手段。三阴性乳腺癌通过蛋白的表达、m RNA和基因组学的不同而分为不同的亚型。三阴性乳腺癌生物学的重要特征包括高增殖活性、免疫侵袭、基底细胞样和间质细胞的表型,部分与BRCA1或BRCA2功能丧失有关。少数三阴性肿瘤表达管腔标记物,如雄激素受体,并具有较低的增殖活性。这些生物亚型目前部分是重叠的,尚无法形成统一的三阴性乳腺癌的生物学模型。由于尚未有激素受体阳性乳腺癌和HER-2阳性乳腺癌类似的明确的治疗靶点,目前三阴乳腺癌依然是乳腺癌领域的治疗难点。现有的临床治疗策略包括改良化疗方法、血管生成抑制剂、免疫检查点抑制剂或抗雄激素治疗等。本文总结了最近的临床试验的结果,并简要介绍了正在进行的相关研究和临床试验。第二部分:三阴乳腺癌和非三阴乳腺癌组织中差异Lnc RNA的筛选和验证三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中的一个重要亚型,因其雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和表皮生长因子受体-2(Her-2)均为阴性,相对于非三阴性乳腺癌,其浸润性较强,复发转移率高、生存时间短,缺乏有效的治疗手段。因此,目前三阴乳腺癌已成为乳腺癌治疗领域亟需突破的难题,对其发生发展分子机制的阐明,具有十分重要的临床意义。近年来,Lnc RNA在其它恶性肿瘤的研究中已证实有丰富的作用方式,如前列腺癌相关转录物-Ⅰ(PACT-1)是一个转录抑制物,通过促进细胞增殖、调节细胞周期而影响前列腺癌的演化进程;T-UCR是人类基因组内高度保守的一段序列,超保守区域的转录产物,在成纤维细胞瘤的表达机制与DNA损伤、细胞周期、细胞分化、细胞免疫有关,但是Lnc RNA在三阴乳腺癌发生发展过程中的作用却不甚明了。本研究拟通过初步筛选三阴乳腺癌中差异表达的Lnc RNAs并通过生物信息学分析揭示差异表达Lnc RNAs可能参与调控乳腺癌的生物学行为,并进一步结合ROC曲线与分子生物学实验揭示差异表达Lnc RNA的临床意义以及其调控乳腺癌生物学行为可能的机制。目的:筛选并验证三阴乳腺癌与非三阴乳腺癌组织之间差异表达的Lnc RNAs,研究其对三阴乳腺癌细胞功能的影响,初步揭示其在三阴乳腺癌中的潜在作用机制。方法:(1)分别取三阴和非三阴乳腺癌组织各3份,使用lnc RNA芯片技术分别检测三阴乳腺癌和非三阴乳腺癌组织中lnc RNAs的表达情况,以2倍以上变化且具有统计学意义(P<0.05)为判断标准,筛选出差异表达的lnc RNAs;(2)综合NCBI Ref Seq,UCSC,RNAdb,Lnc RNAs等数据库资源,对差异表达的lnc RNA进行Gene Ontology,Pathways等初步生物信息学分析;(3)扩大样本量,釆用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)技术,选取差异表达倍率5及以上的lnc RNA,对基因芯片结果进行验证;(4)选取三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231及非三阴乳腺癌细胞MCF-7,TD-47,采用实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)测量经验证的差异表达lnc RNAs在以上三种细胞系中的表达水平;(5)通过ROC曲线评价差异表达的lnc RNAs的特异性和敏感性,并预测其在三阴乳腺癌治疗中的潜在应用价值。结果:(1)对芯片原始数据进行标准化处理和两组比较后,差异表达的lnc RNAs为1664条,其中上调的lnc RNAs880条,下调的lnc RNAs784条;(2)GO(Gene Ontology)分析显示:细胞组分(cellular component,CC):这些差异表达的lnc RNA主要位于细胞内部分(intracellular part),细胞内(intracellular),膜状胞器(membrane-bounded organelle);生物学过程(biological process,BP):其lnc RNA主要参与细胞进程调节(regulation of cellular process)、细胞代谢进程(cellular metabolic process)及生物调节(biological regulation)等过程;分子功能(molecular fuction,MF):其主要具有蛋白结合(protein binding),结合(binding),锌离子结合(zinic ion binding)等功能。Pathways分析显示:这些lnc RNA主要参与了PPAR信号途径,蛋白酶体(proteasome),卵母细胞减数分裂(oocyte meiosis),细胞周期(cell cycle),剪接体(spliceosome),p53信号通路(PPAP signaling pathway),泛素介导的蛋白质(ubiquitin mediated proteolysis),以及内吞(endocytosis)等信号通路;(3)扩大样本量至三阴乳腺癌13例,非三阴乳腺癌39例,q RT-PCR发现在三阴乳腺癌组织中有70个有显著差异表达的lnc RNAs,其中有38个上调的lnc RNAs,32个下调lnc RNAs;(4)在三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231及非三阴乳腺癌细胞MCF-7,TD-4中,有8条Lnc RNAs的表达模式与组织中的结果吻合;(5)ROC曲线显示,这8条lnc RNAs中有6条(RP11-434D9.1,LINC00052,BC016831,IGKV,CTC-338M12.3和C17orf76-AS1)具有诊断意义,这些有可能是三阴乳腺癌治疗的潜在靶标。第三部分:Lnc RNA IGKV在三阴乳腺癌中的功能研究Lnc RNAs是一类转录本长度超过200nt,但并不编码蛋白或者只是编码短多肽的基因转录产物,因为lnc RNAs具有广泛的分子生物学功能,其可从多方面调控基因,从而发挥多靶点的作用,为探讨复杂疾病的病理机制提供了一个新的研究领域。Lnc RNAs与疾病之间的关系已得到越来越多的关注,其在肿瘤、神经退行性疾病中的研究结果显示lnc RNAs有望成为疾病诊断和预后的分子标志物,在疾病治疗方面也有望成为同时针对多个蛋白和信号通路的治疗靶点。目的:深入探索Lnc RNA IGKV在三阴乳腺癌的发生发展中发挥的作用。方法:考虑到三阴乳腺癌细胞最主要以侵袭能力强为特征,通过构建IGKV慢病毒载体并转染三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231,研究其对三阴乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响,接着通过CCK-8、transwell实验等进一步研究IGKV的功能。结果:划痕实验表明,IGKV可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移;CCK-8实验表明,IGKV可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖;trans-well filter实验表明,IGKV可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭能力;FISH和核质分离-定量检测实验表明,IGKV主要分布于细胞核内;聚类分析的结果表明,IGKV过表达后,75条基因上调,140条基因表达下调(变化倍数大于2倍,p<0.05)。差异表达的基因主要参与外源性葡萄糖醛酸代谢、黄酮类化合物的代谢、黄酮类化合物的生物合成、维甲酸代谢过程和脂肪代谢等多种化合物代谢过程,这些差异基因的表达产物主要分布在内质网、F-肌动蛋白复合物、细胞核PML小体、染色体端粒、核孔和转录抑制复合物等细胞亚结构上,主要具备葡糖醛酸基转移酶、核酸转移酶、视黄酸结合、蛋白的异二聚体活动、药物结合、核酸结合、组胺结合、胶原酶结合等生物活性。结论:Lnc RNA IGKV在三阴乳腺癌的发生发展中发挥重要作用,可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖侵袭和迁移,有望成为三阴乳腺癌临床治疗的新靶点。