环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法是一种在等温条件下开展的核酸扩增方式,具有快速、便携、灵敏、特异等优势。本研究拟建立改良的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,在传统的LAMP技术的基础上对结果判定、反应体系和核酸提取方法进行了改良,并基于该方法建立了可视化的布鲁菌和人乳头瘤病毒检测体系,并尝试推广于感染原所在现场或基层医疗机构应用,在本研究中,分别以细菌和病毒各一种为例,完成两部分实验研究。第一部分改良的环介导等温扩增法直接检测患者和羊血液标本中布鲁菌技术的建立目的:建立一种改良的环介导等温扩增(LAMP)技术,应用于患者和传染源羊血液标本中布鲁氏杆菌的检测。方法:首先,针对布鲁氏菌Omp25保守基因序列设计LAMP扩增引物,通过梯度试验对LAMP体系进行优化。然后,分别培养布鲁菌牛、羊、猪属标准菌株和13种革兰氏阴性菌作为阳性和阴性对照,收集2018年5月10日至2019年11月1日确诊为布鲁病患者血液样本104例,健康人群血液样本50例,收集河北、甘肃、内蒙古三地养殖场中疑似感染布鲁菌的羊血液标本共200例作为检测样本,应用煮沸法提取上述菌株及标本的DNA。用优化好的LAMP法分别检测阳性和阴性对照菌株,以验证其特异性;分别应用LAMP体系和Q-PCR法对经梯度稀释的布鲁菌株DNA(10-104 copies/μl)进行检测,对比两种方法的敏感度。最后,分别应用RBPT法、LAMP法和PCR法对临床患者标本进行检测,应用LAMP法和PCR法对羊血标本进行检测,最后应用SPSS 21.0计算不同方法检测结果的Kappa值,对比三种检测方法的一致性,以验证LAMP法在不同标本中的特异性和灵敏度。结果:经LAMP体系优化后发现,LAMP体系中Mg SO4和甜菜碱的终浓度分别为8 m M和0.8 m M时扩增效率最高。LAMP特异性实验中未出现非特异性扩增,说明其特异性较好。LAMP对布鲁氏杆菌标准菌株的检测低限为10 copies/μl,比Q-PCR的检测低限高出一个数量级。LAMP技术应用在患者及羊血液标本中的敏感度和特异性较好(分别为98.70%、100%;100%、100%),与BPAT法及PCR的检测结果统计学差异不明显(Kappa>0.7),且一致性较好(P>0.05)。结论:LAMP技术的敏感度要优于PCR法,且对不同类型的标本检测时,其检测结果与其他方法无异,但鉴于LAMP法操作更为简单,操作风险更低的特点,因此认为LAMP法要更适合条件简陋的基层或现场检测。第二部分改良的环介导等温扩增法直接检测人乳头瘤病毒技术的建立目的:应用改良的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测人乳头瘤病毒(HPV)16、18、52、58亚型,探索可视化LAMP技术在基层或基层医院的应用前景。方法:首先,收集经承德医学院附属医院检验科鉴定为HPV16、18、52、58单亚型感染宫颈脱落细胞标本各1例用于体系建立,收集2018年8月-2018年10月于承德医学院附属医院就诊的疑似HPV感染患者的宫颈脱落细胞标本共452例用于标本检测。然后,分别根据HPV16、18、52、58亚型的E6、E7区域设计LAMP引物并通过梯度试验对LAMP体系进行优化。并应用模板互换实验验证特异性,通过检测梯度稀释后的模板分析其灵敏,通过在体系中加入钙黄绿素并将显色结果与电泳图对比以验证可视化结果的准确性。最后,应用PCR技术对所有临床标本进行定性检测,对检测结果为HPV阳性的标本分别用LAMP及PCR法进行分型。将LAMP和PCR法的分型检测结果应用SPSS 21.0软件计算出kappa值,进行一致性分析,比较两种方法统计学差异。结果:通过优化实验建立了扩增效果更好的LAMP体系,经优化后特异性较好,未出现非特异性扩增情况,对HPV16、18、52、58亚型的检测下限分别为100、103、100、103 copies/μl(其中HPV16、52亚型检测限比普通PCR低一个数量级);加入钙黄绿素后产生的产物肉眼判定的效果和电泳结果相当。通过对临床样本检测得出,452例标本中有163例为HPV阳性标本,占比36.1%,其中LAMP法检测出34例HPV16阳性(22.1%),17例HPV58阳性(10.4%),18例HPV52阳性(11.0%)和6例HPV18阳性(3.7%),.LAMP与PCR的分型检测结果之间统计学差异不明显(Kappa值=0.854,P>0.05),两种方法一致性较好。结论:LAMP具有较好的特异性和敏感性,且临床标本检测能力与PCR一致,但LAMP技术可检测未经纯化的HPV病毒,且检测结果可直接通过肉眼进行判定,操作过程更加简单,更适合条件简陋的基层或现场检测。