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肺炎链球菌是一种常定植在人体鼻咽部的革兰氏阳性胞外菌,感染人体后会引起细菌性肺炎、中耳炎、脑膜炎、败血症等,老人和小孩为易感人群。肺炎链球菌溶血素（PLY）作为肺炎链球菌一种重要的毒力因子,在肺炎链球菌致病机制中发挥着极其重要的作用。PLY可以与细胞膜表面的胆固醇结合,嵌入细胞膜脂质双分子层,通过蛋白质的寡聚化形成跨膜孔致细胞溶解,并且PLY引起广泛的细胞毒性,破坏呼吸道上皮完整性,抑制上皮细胞纤毛运动,破坏中性粒细胞的杀菌能力,改变补体介导的调理作用等。PLY还能激活宿主的天然免疫应答系统产生炎症细胞因子,诱导机体产生免疫应答。肺炎链球菌感染所诱导宿主机体产生一系列细胞因子,其中IL-1α,IL-1β和IL-18对抗肺炎链球菌感染具有重要的作用。我们的前期研究发现:肺炎链球菌感染巨噬细胞后,PLY通过诱导NLRP3和AIM2炎症小体的组装,活化Caspase-1,进而参与IL-1β和IL-18的成熟与分泌过程,但是肺炎链球菌感染巨噬细胞中有关IL-1α成熟与分泌的详细机制尚不清楚。本试验用肺炎链球菌感染小鼠腹腔巨噬细胞,研究肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中IL-1α成熟与分泌机制。1.肺炎链球菌溶血素对IL-1α成熟与分泌的作用研究以肺炎链球菌野生型菌株D39和ply基因缺失型（Δply）菌株分别感染小鼠腹腔巨噬细胞,分别用Realtime RT-PCR、ELISA及Western blotting检测IL-1αmRNA表达水平、上清和细胞裂解物中IL-1α分泌水平及IL-1α的蛋白表达水平。同时,为了进一步验证肺炎链球菌感染巨噬细胞中PLY对IL-1α成熟与分泌的重要作用,用肺炎链球菌Δply菌株加上三种不同浓度的经胆固醇处理后的rPLY感染小鼠腹腔巨噬细胞,分析感染体系上清中IL-1α的分泌水平。试验结果显示:D39和Δply感染巨噬细胞后,都能诱导IL-1αmRNA表达,但经Δply感染的巨噬细胞确不能引起IL-1α的成熟与分泌。与Δply相比,在D39感染上清体系中能检测出IL-1α的成熟片段。而rPLY经胆固醇处理后的感染体系中,其IL-1α的分泌水平下降。上述结果表明:肺炎链球菌感染巨噬细胞后,PLY能够引起IL-1α分泌水平升高。其中PLY的成孔毒性是诱导IL-1α成熟与分泌的重要因素,但PLY不参与IL-1α的转录过程,只对IL-1α的成熟与分泌具有作用。2.炎症小体和巨噬细胞吞噬作用对IL-1α成熟与分泌的影响为研究肺炎链球菌感染巨噬细胞中炎症小体对IL-1α成熟与分泌的影响,利用肺炎链球菌野生型菌株D39分别感染炎症小体组分缺失小鼠(WT、Caspase-1-/-、ASC-/-)腹腔巨噬细胞,ELISA检测感染体系中IL-1α的分泌水平变化,结果显示WT、Caspase-1-/-和ASC-/-巨噬细胞中IL-1α的分泌水平无显著差异。Western blotting结果显示D39分别感染WT、Caspase-1-/-和ASC-/-巨噬细胞后,均能检测到上清中IL-1α的成熟片段。为证实巨噬细胞吞噬作用对IL-1α成熟与分泌的影响,采用试剂阻断方式,经细胞松弛素B处理以抑制巨噬细胞对细菌的吞噬作用,利用ELISA和Western blotting分别检测IL-1α的分泌水平和蛋白表达水平。结果显示巨噬细胞在细胞松弛素B处理后,IL-1α的分泌水平降低,上清中IL-1α的成熟片段蛋白表达量较未处理组降低。试验结果表明:肺炎链球菌感染巨噬细胞中,炎症小体不参与IL-1α成熟与分泌过程,但巨噬细胞对肺炎链球菌的吞噬在IL-1α的成熟与分泌中具有重要作用。3.肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中calpain对IL-1α成熟与分泌的作用以D39感染小鼠腹腔巨噬细胞,3 h后加入多种钙蛋白酶抑制剂（calpain inhibitorⅢ,calpain inhibitorⅣ和EST）和钙离子螯合剂BAPTA-AM,用ELISA检测感染体系中IL-1α的分泌水平,研究肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中calpain对IL-1α成熟与分泌的作用。结果显示加入钙蛋白酶抑制剂和BAPTA-AM后,IL-1α的分泌水平显著降低。用Western blotting检测上清中α-fodrin的降解片段和细胞裂解物中α-fodrin的蛋白水平,结果显示加入多种钙蛋白酶抑制剂和BAPTA-AM后,上清中α-fodrin的降解片段表达量下降。为明确肺炎链球菌感染体系中引起calpain活化的因素,试验先用D39和Δply菌株分别感染巨噬细胞,通过Western blotting检测α-fodrin的降解情况。结果显示与D39相比,Δply感染巨噬细胞体系上清中不能检测出α-fodrin的降解片段;在基本明确Ca2+浓度升高是calpain活化的又一重要诱因,我们开展了进一步的试验,研究在肺炎链球菌感染中Ca2+浓度是否参与IL-1α的成熟与分泌过程。首先加入钙离子螯合剂EDTA、EGTA+Mg2+,ELISA检测感染体系中IL-1α的分泌水平,结果显示加入EDTA、EGTA+Mg2+后,IL-1α的分泌水平显著降低。Western blotting检测感染上清和细胞裂解物中α-fodrin的蛋白水平,结果显示加入EDTA、EGTA+Mg2+后,上清中α-fodrin的降解片段蛋白表达量减少。我们研究还发现在calcium-free环境下,D39感染巨噬细胞后,IL-1α的分泌水平显著下降。但是用Δply菌株感染巨噬细胞3 h后,加入钙离子载体A23187后,培养上清体系中IL-1α的分泌水平显著增加。肺炎链球菌D39与Δply菌株感染巨噬细胞,用Fluo-4 NW试剂盒每隔3 h检测细胞内钙离子的浓度变化,结果显示与Δply相比,D39感染后,细胞内钙离子浓度显著增加。结果表明:肺炎链球菌感染巨噬细胞中,PLY引起钙离子浓度升高,calpain活化,进而参与IL-1α的成熟与分泌过程。上述结果表明肺炎链球菌经巨噬细胞吞噬进入胞内,释放PLY,作用于细胞膜形成跨膜孔,促进胞外钙离子内流,胞内钙离子浓度升高,活化calpain,诱导IL-1α的成熟与分泌。