在蛋白质变性和复性过程中，存在着许多局部能量最小的中间体。中间体蛋白质分子通过缔合作用形成二聚体、多聚体最终形成沉淀，影响蛋白质的复性。可以通过折叠添加剂降低错误折叠蛋白质的稳定性，增加折叠中间体的溶解性。因此，蛋白质折叠机制的阐明存在着重要的理论意义和潜在的应用前景：(1)通过研究各种因素对蛋白质结构的影响，可以高产率、高活性得获得各种蛋白质产品；(2)通过研究维系蛋白质分子结构的各种次级键，通过蛋白质折叠机制的阐明，可以将DNA重组和多肽合成技术得到的多肽链按照意愿设计出具有特定功能的蛋白质；(3)可以认识由蛋白质错误折叠引起的各种疾病的致病机理，寻找到有效的治疗方案；(4)加快蛋白质结构解析的步伐；(5)研究蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等。　　 本文以牛血清蛋白和胰蛋白酶为研究对象开展研究。研究了它们在变性和复性过程中出现的中间体；研究了多种因素对中间体结构的影响；也研究了化学变性剂和药物小分子对蛋白质分子结构的影响。具体内容如下：　　 1.光谱法研究碱诱导变性牛血清蛋白中间体　　 用近紫外、远紫外CD光谱、内源荧光光谱、ANS荧光光谱法发现和表征了牛血清蛋白(BSA)的碱诱导变性pH 11.2中间体。“相图分析”进一步证实了该中间体的存在。结果显示这是一个熔融球中间体，三级结构被严重波坏，二级结构还大量存在。中间体上还具有一定的疏水结合位点，因此具有相当强的ANS荧光。我们认为，该中间体的形成是由于强碱性溶剂改变了蛋白质分子内带电氨基酸的电离平衡，引起蛋白质分子内的近程作用力增强，远程作用力减弱。所以，从整体上看，整个蛋白质分子的结构伸展了，然而，BSA分子的局部结构变得更加紧密。通过对熔融球中间体的表征，有利于加深认识维持蛋白质三维结构的各种作用力，也有利于发现存在于熔融球和天然态以及熔融球和变性态之间可能存在的中间体蛋白。　　 2.盐酸胍诱导的胰蛋白酶折叠一去折叠过程中部分折叠中间体的研究　　 用近紫外和远紫外CD光谱、内源荧光光谱（荧光强度、最大发射波长、色氨酸荧光偏振）和外源ANS荧光等多种物理化学手段研究了盐酸胍诱导的猪胰蛋白酶的变性和复性过程。发现了两种变性中间体。用“相图”的方法进一步证实了这两种中间体的存在。在盐酸胍诱导的猪胰蛋白酶的变性过程中至少存在两个中间体。首先，在～1.8M盐酸胍处，胰蛋白酶转化成一个分子内移动性较低的熔融球。在此状态下，蛋白质分子没有了三级结构，二级结构部分消失。色氨酸周围的微环境变化很小。检测不到明显的ANS荧光。在～3.9M盐酸胍处，胰蛋白酶转化到一个前熔融球状态。转化后，蛋白质分子的三级结构完全消失，二级结构也大部分消失。内源荧光发生明显的红移，荧光偏振度降低。当盐酸胍的浓度大于4.0M时，胰蛋白酶完全变性。　　 3.光谱技术研究6-巯基鸟嘌呤和牛血清蛋白之间的相互作用　　 用紫外吸收光谱、CD光谱和荧光光谱研究了6一巯基鸟嘌呤(6-TG)和BSA之间的相互作用。6-TG对BSA的熄灭是静态熄灭过程。用荧光熄灭方法计算出了二者之间的结合位点数和结合常数。热力学参数，△H0，△G0,和。△S0，指示6-TG和BSA之间的作用是熵驱动的，疏水作用力在结合过程中发挥着最重要的作用。根据Forster无辐射能量转移理论，供体(BSA)和受体(6-TG)之间的距离被估算。同步荧光光谱显示6-TG结合到BSA上后，蛋白质中色氨酸周围的极性升高，疏水性降低。荧光熄灭主要来源于色氨酸荧光而是不是酪氨酸荧光。CD光谱显示，随着6-TG结合牛血清蛋白，蛋白质分子中的a-螺旋含量逐渐降低。6-TG和BSA结合后，CD光谱的形状并没有发生大的变化，说明该药物分子结合在BSA上后，蛋白质分子的二级机构依然以a-螺旋为主。　　 4.脲和盐酸胍对6-巯基鸟嘌呤和牛血清蛋白相互作用的影响　　 用荧光光谱的方法研究了脲和盐酸胍存在和不存在两种情况下6-TG和BSA之间的相互作用。天然态BSA的荧光光谱只在338nm处有个峰；而变性态的BSA分别在304-306nm和348nm处呈现出两个波峰。后者随着变性剂浓度的增加逐渐红移。BSA分子F304和F34s的变化反映出，随着变性剂浓度的增加，酪氨酸荧光对总荧光强度的贡献越来越大。6-TG无论是对天然态的还是变性态的BSA都有熄灭作用。在变性念的BSA中，6-TG对BSA的熄灭作用主要来源于酪氨酸荧光而不是色氨酸荧光。随着变性剂浓度的升高，6-TG和BSA之间的熄灭常数和结合常数都降低。光谱分析显示，在两种变性剂环境中，6-TG对BSA都有一定的抗变性效果。随着变性剂的加入，6-TG对BSA的抗变性能力降低。　　 5.近生理浓度的脲对核黄素与牛血清蛋白结合作用的影响　　 用CD光谱和荧光光谱法研究了近生理浓度的脲存在和不存在两种情况下核黄素和牛血清蛋白之间的相互作用。一定浓度的核黄素结合在牛血清蛋白分子上可以引起BSA分子结构的伸展，二级结构和三级结构减少。近生理浓度下的脲可以诱导核黄素变性后的牛血清蛋白的二级结构和三级结构得以部分恢复。在近生理条件下的脲存在时，核黄素对牛血清蛋白的熄灭常数（K）以及供体牛血清蛋白和受体核黄素之间的距离(r)增大了。相反地，结合常数（Ka）和结合位点数(n)减小了。在近生理条件下的脲存在下，核黄素和牛血清蛋白的结合作用是一个熄灭作用增强，而结合作用减弱的过程。人血清蛋白(HAS)分子和BSA分子的结构非常相似。人体内血脲的正常浓度范围是0.0025-0.0075 mol/L。当血脲浓度偏离正常范围达到0.01 mol/L时，由于核黄素和HAS分子的弱结合作用可以导致人体血浆中的核黄素缺乏，使人患病。众所周知，核黄素在帮助一些生物大分子进入细胞的过程中发挥着非常重要的作用。一些病人可能会因为缺乏核黄素，结合着药物的生物大分子不能被有效地转移进细胞内，不能被某些药物有效地治疗。　　 6.阳离子、阴离子和非离子表面活性剂对碱诱导变性牛血清蛋白中间体的影响　　 三种表面活性剂，CTAB、SDS、Tween-20，促使碱诱导变性pH 11.2中间体恢复了二级结构和三级结构。在表面活性剂存在下，中间体分子中内埋的色氨酸残基移向更加极性的环境。无论是对二级结构还是对三级结构的诱导，都存在以下顺序：3.5mM CTAB>8.0mMSDS>0.1 mM Tween-20。在0.1 mM Tween-20中，中间体的ANS荧光强度最大，其次是在8.0mM SDS。3.5 mM CTAB和pH 11.2中间体混合导致该中间体上ANS的结合位点数减少。通过比较三种表面活性剂对Ph 11.2中间体绪构的影响，提出了每种表面活性剂和中间体结合形成复合物的作用力类型。考虑到表面活性剂在蛋白质分离和纯化过程中的广泛应用，表征在各种表面活性剂下碱诱导变性形成的熔融球中间体的结构具有非常重要的意义。　　 7.不同分子量的聚乙烯醇对碱性诱导变性牛血清蛋白中间体的影响　　 研究了各种浓度的高、中、低分子量的聚乙烯醇对BSA pH 11.2中间体结构的影响。用PEG 400处理pH 11.2中间体，诱导出了二级结构和三级结构。当PEG 8000以及PEG 20000和pH 11.2中间体混合时，中间体的二级结构和三级结构都减少。它们诱导该中间体转化成另外一个中间体。新中间体的疏水斑块难以接近。表征在各种分子量的聚乙烯醇存在下碱诱导变性形成的熔融球中间体的结构可以加深对BSA折叠机理的认识。中、高分子量的聚乙烯醇PEG 8000和PEG 20000对中间体结构的破坏作用提醒我们在蛋白质的盐析和结晶过程中要谨慎使用这些类型的聚乙烯醇。