银杏花芽3个分化时期转录组测序及开花基因的筛选与表达分析

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银杏(Ginkgo biloba L.)是地球上现存的最古老树种之一,是我国特有的集食用、药用和观赏等多种价值于一体的经济树种。我国拥有全世界的80%以上的银杏资源,近二十年来,银杏产业发展迅速,然而,银杏是单科单属单种的孑遗植物,遗传背景狭窄,优良品种缺乏,选育难度大。而且,银杏童期长达20年,又名公孙树,严重限制了银杏育种的进程,也降低了农民栽培的积极性。另外,虽然银杏常作为庭园、行道树,但由于其外种皮的异味和花粉的飞扬,导致其应用范围也十分有限。因此,银杏优良品种的选育是银杏产业亟待解决的核心问题。缩短银杏的童期,培育早花品种对于银杏的推广种植十分关键。揭示银杏开花调控的分子机理,则是解决这一关键问题的前提条件。鉴定银杏开花调控的关键基因,揭示银杏开花调控的主要分子机制,为选育银杏早花品种提供理论指导。  1、采用高通量测序技术对银杏3个发育时期(花芽未分化期、花芽分化始期、花芽分化盛期)的样本进行转录组测序,并通过数字表达谱分析筛选与银杏开花调控相关的基因和代谢途径。转录组测序共产生52.34 Gb原始数据,各样品数据量均达到7.13 Gb以上。序列比对发现,银杏基因与裸子植物北美云杉(Picea sitchensis)的同源基因数量最高(10,834,31.14%),其次是同为孑遗植物的无油樟(Amborella trichopoda)(3,675,10.56%),再其次是莲(Nelumbonucifera)(2,721,7.82%);注释到8大功能数据库(GO、COG、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG)上的Unigene总数为35,179个,在大部分数据库中注释的Unigenes数量都超过20,000条。Unigene GO数据库比对分析,序列分成分子功能、细胞组分、生物过程3个大类50个小类。其中,代谢过程(7,344条)、催化活性(5,440条)、细胞过程(3,314条)、细胞成分(2,638条)、单一有机体进程(2,570条)等富集程度较高。Unigenes与COG数据库比对并进行直系同源分类,结果显示共分为25个类别,其中R(一般功能预测)包含的基因数最多,有3,356条,L(复制、重组、修复)2,234条、K(转录)1,710条和T(信号转导机制)1,504条等途径数量较多。  2、银杏转录组差异表达基因分析显示,花芽分化始期vs.花芽未分化期有2,253个基因上调,2,032个基因下调;花芽分化盛期vs.花芽分化始期有1,770个基因上调,1,901个基因下调;花芽分化盛期vs.花芽未分化期有1,865个基因上调,2,042个基因下调。KEGG分析表明,差异表达基因多富集于与花芽分化相关的代谢途径中。发掘出大量与开花相关的基因,并分析其表达模式,筛选出与开花相关的6个候选关键基因:gene.Gb_17618(GI基因)、gene.Gb_19790(FT/TFL1同源基因)、gene.Gb_16301(AG同源基因)、gene.Gb_28337(花发育MADS-box基因)、gene.Gb_41704(CO同源基因)、gene.Gb_01884(SOC1同源基因GbMADS9)。  3、结合转录组数据库对银杏短枝茎端花芽进行qPCR内参基因选择,为后期的银杏相关基因的表达分析提供一个可靠的均一化标准。采用qPCR技术分析了银杏中6个管家基因18S rRNA(18S核糖体RNA)、Actin-7(肌动蛋白)、β-TUB(β微管蛋白)、DNAJ(DnaJ蛋白)、EF1a(转录延伸因子)、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)的表达量,再使用geNorm和Norm Fmder软件,对6个候选内参基因在银杏花芽中的表达稳定性进行评价。筛选出表达稳定的GADPH基因作为内参基因。然后,通过qPCR筛选出的内参基因检测6个候选关键基因gene.Gb_17618、gene.Gb_19790、gene.Gb_16301、gene.Gb_28337、gene.Gb_41704、gene.Gb_01884的表达量以验证转录组数据库的正确性,确保分析结果的真实性和准确性。结果显示,定量PCR结果与转录组数据分析结果一致。
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