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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的,其中3周龄以内的雏鸭易感,病鸭以神经症状和肝脏病变为显著特征,属于急性、高度致死性传染病。DHV主要包括鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)和鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)。DHAV根据血清型的差异,分为DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3,其中DHAV-1毒力较强,且感染情况越来越复杂,普遍继发其它疾病造成混合感染,严重危害养鸭业的发展。实际生产中较少使用疫苗防控DHAV-1,在雏鸭感染DHAV-1后注射卵黄抗体,效果较好。乳酸菌基于其本身有益菌的特性,在食品发酵、药物生产、饲料添加等领域广泛应用,近年来开始应用于分子遗传和基因工程等领域,尤其是乳酸菌具备蛋白重组载体口服疫苗的潜力备受关注。为了减少鸭养殖中抗生素的使用,降低易感风险,减少大群死亡率,规避毒力恢复和免疫失败的风险,使雏鸭在易感期内获得保护性抗体,本研究旨在研发一种新型微生态制剂,充分利用分子生物学技术,将乳酸菌在基因工程水平上进行改造。本研究将1型鸭甲肝病毒的主要衣壳蛋白VP1构建到已有研究的乳酸菌表达系统中,通过基因的转录翻译水平元件,利用乳酸菌做活载体将抗原蛋白呈递到细胞外,刺激机体的黏膜免疫系统,产生特异性抗体,保护机体抵抗DHAV-1的侵袭。研究内容主要包括以下两部分:第一部分:表达1型鸭甲型肝炎病毒VP1蛋白重组乳酸乳球菌株的构建为了将胞内表达的外源蛋白及时分泌到胞外,选用乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363作为载体菌,利用具有滚环复制方式的组成型大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e作为表达载体,为进一步促进目的蛋白实现胞外分泌表达,在目的基因VP1的N端融合一段Usp45信号肽序列,在信号肽引导下将目的蛋白进行跨膜转运出细胞壁,将成熟蛋白释放到胞外。利用融合PCR的方法构建质粒Usp45-VP1-pMG36e。将重组质粒通过电穿孔转化进乳酸乳球菌MG1363中,成功构建了Usp45-VP1-pMG36e/MG1363重组乳酸乳球菌。对VP1蛋白在重组乳酸乳球菌胞内胞外的表达情况进行鉴定,经Western Blot检测结果证明在菌体胞内、胞外均检测到特异性的VP1蛋白,成功表达大小约26kDa的融合蛋白VP1;同时对重组乳酸菌进行间接免疫荧光实验,VP1重组乳酸菌在FITC荧光标记下发出绿色荧光,两者皆表明了该系统表达融合1型鸭甲肝病毒VP1蛋白的可行性。第二部分:VP1蛋白重组乳酸菌免疫效果的评价分别将含有Usp45-VP1-pMG36e质粒重组乳酸乳球菌MG1363和pMG36e空载体质粒重组乳酸乳球菌MG1363口服免疫1日龄雏鸭,连续饲喂7天,以空白组做阴性对照。ELISA检测口服免疫24 h后血清和小肠液中的DHAV-1特异性抗体水平及细胞因子水平,对免疫效果进行评价,结果显示VP1重组乳酸乳球菌实验组血清中特异性IgG抗体和肠黏膜SIgA抗体水平以及IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ各细胞因子水平与其他对照组比较均差异性显著(P<0.05)。第8天每组分配两只肌肉注射DHAV-1强毒株的雏鸭,模拟自然感染方式,监测每组雏鸭的死亡率,VP1重组乳酸菌组雏鸭的保护率达80%。本研究构建的乳酸乳球菌活载体疫苗为今后DHAV-1的防控提供一种新途径。