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microRNAs(miRNAs)是一种非编码小分子RNA,对生物的进化有着重要的调节作用。miR-144/451基因簇在红细胞生成过程中大量表达,能够调控红细胞的发育和抗氧化途径。miR-144与miR-451在一个双顺反子初级转录本中共表达,但是这两个miRNAs的序列完全不同。有研究表示,尽管序列不同,但敲除miR-144和miR-451都可以抑制红细胞的生成,说明miR-144和miR-451具有相似的生物学效应,然而,这一现象还没有在任何基因敲除的动物中得到验证。转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,Tfr1)是一种细胞膜受体,对细胞铁的摄取有着关键作用。在Tfr1的作用下,细胞外的铁离子进入细胞内,合成红细胞生成所必须的血红蛋白。在红细胞发育的早期阶段,细胞膜上Tfr1的表达逐渐增加,当红细胞发育到晚幼红阶段,Tfr1的表达则开始减少,直至红细胞成熟,细胞膜上Tfr1才会丢失。在胚胎发育时期,敲除Tfr1,会引起造血系统的渐进性损伤,造血前体细胞的增殖和分化出现障碍,进而出现胚胎宫内死亡的现象。本课题组前期已发表的研究数据表明,当特异性的敲除miR-144/451基因,小鼠会出现轻度的小细胞溶血性贫血。且有研究表示,miRNA可靶向Tfr1的3’UTR,miRNA表达降低可以导致肝癌细胞中Tfr1表达水平升高。但是,miR-144/451是否能调控红细胞中的Tfr1尚未见到报道。本课题组首先通过流式细胞术和qRT-PCR技术检测WT和mKO小鼠不同组织中Tfr1的表达情况,明确miR-144/451敲除后,Tfr1表达降低的现象。为明确miR-144和miR-451对Tfr1的调节作用,本课题组利用Crispr/Cas9技术构建了 miR-144和miR-451单敲除小鼠模型。然后,利用野生型小鼠(WT)、miR-144单敲除小鼠(miR-144 KO)、miR-451单敲除小鼠(miR-451 KO)、miR-144/451敲除小鼠(mKO)作为研究对象,检测四种基因型小鼠不同组织中Tfr1和Tfr1涉及的铁的表达情况,并对其机制进行初步的探究,为miR-144/451调节红细胞的发育提供新的理论依据。方法:1.流式细胞术检测WT和mKO小鼠胚胎肝、骨髓、脾脏和外周血中Tfr1的MFI,磁珠分选骨髓、脾脏中的有核红细胞,提取有核红细胞中的总RNA,反转录成cDNA,通过qRT-PCR技术检测Tfr1 mRNA表达水平。2.利用Crispr/Cas9技术构建miR-144和miR-451单敲除小鼠模型,采用杂合子-杂合子杂交的方法取得纯合子小鼠,然后,通过PCR技术鉴定小鼠基因型,并统计是否符合孟德尔遗传定律。3.全血细胞仪检测四种基因型小鼠的外周血细胞,解剖小鼠,称取脾脏重量同时拍照记录。4.流式细胞术检测四种基因型小鼠的骨髓、脾脏和外周血中Tfr1的MFI。5.检测Tfr1对铁代谢通路的影响:ELISA检测四种基因型小鼠的外周血中的血清铁蛋白含量;对小鼠的骨髓和脾脏进行铁染色,观察游离铁的分布情况;流式细胞术检测细胞内铁的表达。6.提取四种基因型小鼠胚胎肝细胞中的总RNA与总蛋白,检测在胚胎肝时期,Tfr1的mRNA与蛋白表达水平,并且同时检测miR-144和miR-451的靶基因Rab14的mRNA与蛋白表达水平。结果:1.流式细胞术检测Tfr1的蛋白表达水平,结果显示,与WT小鼠比较,mKO小鼠的胚胎肝细胞、骨髓和脾脏有核红细胞以及外周血细胞中Tfr1的表达水平均有所下降,而mKO小鼠的骨髓和脾脏有核红细胞中Tfr1 mRNA的表达水平升高。2.成功构建miR-144和miR-451单敲除小鼠,并且经统计子代各基因型小鼠的存活率符合孟德尔定律。3.全血细胞仪分析结果显示miR-451 KO与mKO小鼠都有血红蛋白下降,红细胞分布宽度增加的现象;解剖小鼠,发现miR-451 KO与mKO小鼠的脾脏有轻度代偿性增大。4.流式细胞术检测四种基因型小鼠的骨髓、脾脏和外周血中Tfr1的MFI,结果显示,miR-144 KO小鼠的Tfr1的MFI下降最为显著。5.在四种基因型小鼠中,miR-144 KO与mKO小鼠的铁蛋白含量有所增加;铁染色发现,mKO小鼠的脾脏有“铁沉积”的现象;细胞膜渗透性染料Phen-Green-SK标记四种基因型小鼠的外周血红细胞中的胞内铁,结果显示,四种基因型小鼠没有明显差异。6.在胚胎肝时期,Tfr1的mRNA与蛋白表达水平都是呈降低趋势;Rab14 mRNA表达水平在miR-451 KO与mKO小鼠的胚胎肝细胞中增高,Rab14的蛋白却是在miR-144 KO与mKO小鼠的胚胎肝细胞中增高。结论:miR-144与miR-451可能通过靶向Rab14来调节红细胞生成过程中的Tfr1的表达,并且在此过程中miR-144起着主要作用。