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胚胎发育是精卵结合表观重编程的过程,DNA甲基化是表观重编程修饰的一种主要形式,参与细胞的多种生理活动。DNA甲基化可使参与胚胎发育的基因有序表达,维持胚胎的正常发育。牛是单胎动物,为提高牛的繁殖力,更多地采用体外培养的方式获得牛早期胚胎,然后进行移植。但由于各种原因,体外胚易发生早期死亡,其成活率远低于体内胚,对畜牧业生产造成一定的损失。目前已证实异常的DNA甲基化导致胚胎发育失败,因此本文从早期胚胎死亡角度出发,采用亚硫酸氢盐测序法,研究与牛早期胚胎发育相关基因OCT4、Nanog启动子区的甲基化,以揭示与胚胎发育相关基因的甲基化模式,推测克隆胚发育失败的原因,进而预测早期胚胎死亡的可能信号,提高体外胚的成活率,指导实验室生产。研究结果如下：1.本试验以牛的孤雌胚胎为材料,探讨获得高浓度胚胎基因组DNA的方法。结果表明：首先使用蛋白酶K除去透明带,然后用本试验方法可以获得浓度相对高的基因组DNA。2.检测了OCT4基因在不同时期死亡胚胎的甲基化模式。结果表明OCT4基因在2-细胞、4-细胞、8-16细胞和桑葚胚阶段死亡的克隆胚的甲基化水平分别为90.50%、90.00%、92.30%、77.70%,在体外受精胚的2-细胞、4-细胞、8-16细胞、桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为87.80%、81.10%、88.50%、70.60%。表明OCT4基因启动子在早期死亡胚的甲基化水平较高,且在克隆胚的甲基化水平高于体外受精胚的甲基化水平,但克隆胚和体外受精胚各阶段甲基化差异不显著(P>0.05)；同时克隆胚和体外受精胚OCT4的甲基化水平从8-16细胞到桑葚胚呈下降趋势。3.检测了Nanog基因在不同时期死亡胚胎的甲基化模式。研究表明Nanog在克隆胚的2-细胞、4-细胞、8-16细胞和桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为46.15%、42.31%、48.46%、53.85%,在体外受精胚的2-细胞、4-细胞、8-16细胞、桑葚胚阶段死亡的甲基化水平分别为63.85%、56.92%、69.23%、53.07%。表明Nanog基因启动子在早期死亡的体外受精胚的甲基化水平较克隆胚的高；在早期死亡的克隆胚中,Nanog甲基化水平从8-16细胞到桑葚胚时上升,而在体外受精胚则下降。同时Nanog启动子在体外受精胚的甲基化水平高于克隆胚。4.总的来说,早期死亡胚中,OCT4基因启动子的甲基化高于Nanog的,推测可能由于OCT4异常的甲基化使Nanog发生异常甲基化,二者异常的甲基化可能导致早期胚胎的死亡5.对甲基化水平存在差异的阶段进行定量分析。结果表明：不论何种方式获得的早期死亡的胚胎,其OCT4的表达量高于Nanog,且只在桑葚胚时期检测到少量Nanog的表达。推测可能由于OCT4的过度表达限制了Nanog的表达。6.结合以上推测2-细胞阶段可能是早期胚胎死亡的信号,因此可考虑体外培养时加入一定浓度的抑制剂以提高体外成活率。