第一部分：乙型脑炎病毒全基因克隆的研究 我国是唯一使用乙型脑炎减毒活疫苗的国家，活疫苗使用的毒株为SA-14-14-2。该毒株是将乙脑病毒强毒株SA14株通过地鼠肾细胞在36℃下长期培养传代，在100代后进行多次噬斑筛选获得的稳定弱毒株。减毒活疫苗株SA14-14-2株基因序列与强毒株SA14相比有57个碱基差别，导致它所编码的减毒株多蛋白前体24个氨基酸发生改变。减毒活疫苗SA14-14-2自1989年被批准投产至今累积接种人数超过2亿人，疫苗的安全性和免疫保护效果已得到充分证实。 本文用RT-PCR的方法分两段扩增并克隆了乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2株全基因组序列，利用低拷贝质粒pBR322构建了SA14-14-2株全基因cDNA克隆，引入一个点突变作为遗传标记。经观察细胞病变、ELISA、RT-PCR、间接免疫荧光实验、WesternBlot等多种实验方法检测，证实从全基因cDNA克隆获得的体外转录产物对BHK-21细胞有感染性。我们注意到全基因克隆在不同菌株中的稳定性是不同的，在XL1-Blue中传5代保持全基因cDNA克隆结构和功能的完整。这个反向遗传系统将有助于对乙脑病毒特别是减毒活疫苗株SA14-14-2的分子生物学研究，并有希望发展以乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2为载体的新型减毒活疫苗。 登革病毒(DengueVirus)也是黄病毒属的重要成员，由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，分为四个血清型，引起人类登革热、登革出血热和登革休克综合征。世界卫生组织估计每年全世界发生5000万例登革热感染，而且登革热和登革出血热的传播地域、发病率在全球范围不断增长，成为公共卫生领域的新的挑战。登革病毒的免疫病理和疫苗研究一直是研究的难点，而以乙脑病毒SA14-14-2感染性克隆为基础构建嵌合病毒cDNA克隆将为解决这些难点提供新的思路和新的方法。 在乙脑病毒感染性克隆的基础上，用登革病毒2型的prM/E基因替换乙脑病毒SA14-14-2株的prM/E基因，构建了乙脑病毒—登革病毒2型的嵌合病毒cDNA克隆。通过引入突变，在嵌合基因的两端增加了两个酶切位点，便于构建其他三个型别登革病毒的嵌合病毒。经观察细胞病变、ELISA、RT-PCR、间接免疫荧光实验、WesternBlot等多种实验方法检测证明嵌合病毒体外转录产物对于BHK-21细胞有感染性。研究发现嵌合病毒cDNA克隆在XL1-Blue菌株中能够稳定传代至少5代。这一嵌合病毒感染性克隆的成功构建为研究登革病毒的致病机理和发展以乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2株感染性克隆为基础的四价登革减毒活疫苗奠定了基础。 第二部分：黄病毒诊断方法的研究 黄病毒属有接近80种病毒，至少40种是虫媒传播的人类病原，能够导致人类多种疾病如发热、出血热、脑炎、脑脊髓膜炎、全身性感染等。由于资源的开发、频繁的人员交流和城市化的加剧，黄病毒感染成为公共卫生领域的严重挑战。黄病毒感染的临床表现复杂，一方面同一种病毒可以引起不同的临床表现，另一方面不同的病毒可以引起相同的临床表现。所以仅仅依靠临床症状和流行病学资料很难确定某一病例的真正病原，最终的确诊往往需要实验室的诊断。实验室诊断的难点在于鉴别诊断，因此，必须加强实验室的诊断能力。 黄病毒感染的实验室诊断包括检测临床标本中的病毒抗原、病毒核酸、抗病毒抗体和病毒分离等。黄病毒属的病毒在基因组结构，病毒毒粒组成和结构，抗原性等方面比较保守，因此存在严重的血清学交叉反应，一些血清学检测方法难以区分抗原性非常接近的黄病毒，单纯依靠血清学实验鉴别不同黄病毒感染往往会有困难。所以，利用PCR方法检测病毒核酸进行黄病毒感染的鉴别诊断有很大优势。PCR方法可以同时对多种病毒进行检测，特别适合对症状相似的黄病毒感染进行鉴别。根据GenBank中的序列，设计了针对这7种黄病毒的套式PCR引物，初步建立了检测7种黄病毒核酸的RT-PCR方法。 第三部分：SARS冠状病毒相关研究 SARS于2002年秋季在中国广东爆发，迅速蔓延到全球其他国家和地区。这是新世纪的第一个新发传染病，它的病原是SARS冠状病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属，是不分节段的单链正链RNA病毒，结构蛋白为S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白，非结构蛋白为病毒的复制酶。 对于SARS的控制和预防，需要一种快速特异的早期实验室诊断方法。检测患者血清中的特异的IgM抗体是一种常用的病毒性疾病早期诊断方法，我们克隆了SARS冠状病毒北京分离株SCV8株的核蛋白基因，并克隆到原核表达载体中，获得了表达，经金属螯合层析纯化，标记辣根过氧化物酶之后发展了一种新型的检测患者抗SARS冠状病毒核蛋白IgM的ELISA检测方法MacELISA，检测了多份阳性血清和阴性血清，证实了敏感性和特异性。 PCR方法因为快速、敏感而且可以定量的优点被应用于SARS冠状病毒的诊断。能够在发病早期获得阳性结果，便于采取治疗管理等措施。 本文在两例广东确诊的SARS死亡病例的尸解标本中利用RT-PCR的方法扩增得到SARS冠状病毒RNA聚合酶的一段序列，并进行了序列比对，证实为SARS冠状病毒序列，设计了针对不同基因的多对引物，筛选出一套较为敏感的引物，并对扩增条件进行了优化，获得了效率较好的一套引物。 发展一种有效的疫苗对于SARS的预防与控制有重要意义。将SARS冠状病毒北京分离株SCV8株接种Vero细胞，37℃培养，收获上清，β丙内脂灭活之后进行安全传代实验，然后经阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，获得了初步纯化的灭活疫苗，所制备的疫苗已经通过检定。