【摘 要】
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牦牛(Bos grunniens)起源于中国,是中国的原始物种,主要分布在青藏高原和周围海拔3000m以上的高原地区,牦牛适应高寒、低氧能力较强,但生育能力较为低下,流产率高,从而严重影响了牦牛的繁殖以及当地经济发展。本研究选取牦牛卵巢作为研究对象,探究透明质酸合成酶2(Hyaluronate synthase 2,HAS2)和前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endopero
【基金项目】
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国家自然科学基金(31972760); 甘肃省教育厅产业支撑引导项目(2019C-03); 甘肃省教育厅创新能力提升项目(2019B-081);
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牦牛(Bos grunniens)起源于中国,是中国的原始物种,主要分布在青藏高原和周围海拔3000m以上的高原地区,牦牛适应高寒、低氧能力较强,但生育能力较为低下,流产率高,从而严重影响了牦牛的繁殖以及当地经济发展。本研究选取牦牛卵巢作为研究对象,探究透明质酸合成酶2(Hyaluronate synthase 2,HAS2)和前列腺素内过氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)在牦牛不同时期卵巢的定位与表达以及探究FGF10处理牦牛颗粒细胞对HAS2和PTGS2的表达影响。采集使用临床健康牦牛不同时期(卵泡期、黄体期、妊娠期)的卵巢组织和使用浓度为0、0.5、1、5、10、20ng/m L的FGF10作用于颗粒细胞为研究对象,提取卵巢组织和颗粒细胞总RNA和蛋白,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,q RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)方法检测牦牛不同时期卵巢中HAS2和PTGS2基因表达和体外培养颗粒细胞过程中添加外源FGF10后对HAS2和PTGS2基因的表达影响,采用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)法检测HAS2和PTGS2在不同时期卵巢中的分布情况以及免疫荧光法检测HAS2和PTGS2在颗粒细胞定位表达。结果如下:(1)HAS2基因在黄体期卵巢的表达量显著高于卵泡期和妊娠期(P<0.05),卵泡期卵巢表达量显著高于妊娠期(P<0.05);PTGS2基因在黄体期卵巢表达量显著高于其他2个时期(P<0.05),在卵泡期卵巢表达量显著高于妊娠期(P<0.05)。HAS2蛋白在3个时期的卵巢中均有表达,其中黄体期卵巢表达量显著高于其他2个时期(P<0.05),妊娠期显著高于卵泡期(P<0.05);PTGS2在黄体期表达量显著高于其他2个时期(P<0.05),卵泡期显著高于妊娠期(P<0.05)。IHC试验表明,HAS2和PTGS2蛋白在黄体细胞、颗粒层和卵丘细胞中表达。(2)使用不同浓度0,0.5,1,5,10和20ng/m L的FGF10作用颗粒细胞之后,卵丘扩展相关基因HAS2和PTGS2表达与FGF10浓度呈正相关。HAS2基因表达量在FGF10浓度1ng/m L时表达量最高且显著高于其他处理组(P<0.05),0.5ng/m L、5ng/m L和10ng/m L相比表达量差异性不显著(P>0.05),但与对照组(0ng/m L)相比差异显著(P<0.05)。PTGS2基因在10ng/m L组表达量最高(P<0.05),与对照组(0ng/m L)相比,0.5ng/m L和1ng/m L处理组中的表达差异性不显著(P>0.05)。HAS2蛋白在1ng/m L时表达量显著高于其他处理组,0.5ng/m L、5 ng/m L和10 ng/m L处理组表达差异不显著(P>0.05),PTGS2蛋白在1ng/m L处理组中表达量显著高于其他组(P<0.05)。免疫荧光结果显示HAS2和PTGS2在细胞质与细胞核中均有表达。(3)体外培养牦牛颗粒细胞,经过鉴定,FSHR和LHR在牦牛颗粒细胞中均呈阳性表达。综上,结果表明HAS2和PTGS2在牦牛不同时期卵巢表达且具有显著差异性(P<0.05),黄体期表达量与其他组相比最高且具有显著性差异(P<0.05),推测HAS2和PTGS2可能参与牦牛卵母细胞发育成熟、黄体生成和退化以及胚胎早期发育有关。HAS2和PTGS2在不同浓度FGF10作用的颗粒细胞中表达具有一定差异性(P<0.05),呈浓度依赖性表达,作用效果与FGF10浓度有关,HAS2和PTGS2基因在FGF10为1ng/m L时作用效果最佳,证明FGF10参与牦牛HAS2和PTGS2的表达调控,参与卵丘扩展生殖生理活动。以上研究结果为进一步研究生长因子对牦牛卵丘扩展生殖相关的影响机制提供了依据。
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