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目的:尤文肉瘤(Ewing sarcoma，ES)是常见的原发性恶性骨肿瘤，多发生于5～20岁青少年。恶性程度高的临床表现，晚期难以切除，早期易发生转移。尽管新辅助化疗将ES病人5年生存率达到70％，但是对于有转移灶存在或复发性病人预后仍然较差。90～95％的尤文肉瘤表现出异常的基因融合EWS-FLI1的表达，由于染色体易位t(11，22)(Q24，Q12)。融合产物EWS-FLI1是参与调节细胞增殖，分化，凋亡，血管生成，侵入和转移病理学的转录因子。与传统的化疗方案相比，特异的分子靶向治疗方法，包括胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)，哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)，酪氨酸激酶如血小板源性生长因子受体(PDGFR)，上皮生长因子受体(EGFR)，血管上皮生长因子受体(VEGFR)以及Aurora A和多聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)均处于Ⅰ和Ⅱ期临床试验中。RNA聚合酶是在细胞的DNA中的RNA的催化剂。RNA聚合酶Ⅰ催化产生的5.8S和28S rRNA的18，它是产生的rRNA所需要的调节酶。RNA聚合酶Ⅱ参与mRNA合成的转录过程;tRNA，5S rRNA和最SnRNA和某些病毒基因(如基因VA)的转录由RNA聚合酶Ⅲ催化。通过RNA聚合酶Ⅰ所产生的rRNA是在细胞中最丰富的RNA和核糖体蛋白一起组成了核糖体，成为蛋白质合成的位点同时合成控制细胞生长和增殖。在恶性肿瘤中，RNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)合成Rrna导致细胞增值的失控。rRNA是核糖体的重要组成部分，其合成的增加具有致癌作用。我们目前己知，失去控制、过量转录的rRNA与恶性肿瘤细胞无限增殖有关。作为合成rRNA的多分子蛋白复合物，RNA聚合酶Ⅰ在癌细胞中有着广泛的活性。因此选择性的抑制RNA聚合酶Ⅰ能够阻止恶性肿瘤的细胞增殖，为临床抗肿瘤治疗提供新的靶点。最近才被发现的CX-5461，作为一种选择性的RNA聚合酶Ⅰ抑制剂可表现出rRNA合成的抑制效果与抗肿瘤效能。在本次研究中，我们证明CX-5461可诱发尤文肉瘤细胞周期subG1出现，并引起cleavedPARP过度表达。CX-5461介入后尤文肉瘤细胞中LC3B-Ⅱ的表达不变，p21的表达下调。此外，CX-5461可以显著地抑制抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xL的mRNA和蛋白水平。同时降低SK-N-MC细胞中p-Akt(Ser473)和下游效应器P-mTOR(Ser2448)的表达。我们的数据表明CX-5461可能通过抑制Akt/mTOR相关信号通路引起尤文肉瘤细胞凋亡。这些结果提示CX-5461有希望在尤文肉瘤的临床治疗上提供新的选择，前景光明。 实验方法:1、MTT实验/细胞活性分析:将SK-N-MC和SK-ES-1细胞植入96孔板内，用不同浓度的CX-5461处理72小时，然后进行MTT实验分析，用两种尤文肉瘤细胞系SK-N-MC和SK-ES-1来研究CX-5461对于细胞生长的效应。:2、流式细胞仪分析:收集各组细胞，用冷PBS洗涤。细胞通过离心收集并在4℃加入到70％乙醇过夜。细胞DNA染色用碘化丙啶(50毫克/毫升)和核糖核酸酶A(1毫克/毫升)处理30分钟，在37℃。用流式细胞仪分析细胞中的状态，通过观察细胞分布变化及细胞比例大小。3、蛋白免疫印迹实验:细胞收集后，用NonidetP-40-based裂解缓冲液裂解。使用抗体如下:一抗anti-p21（美国），anti-LC3B-Ⅱ（美国），anti-Akt（美国），anti-phospho-Akt(Ser473)，anti-mTOR，anti-phospho-mTOR(Ser2448)，anti-bcl-2和anti-bcl-xL(Cell Signaling Technology公司，美国)，anti-cleavedPARP(promega公司，美国)与anti-actin(CHEMICON International公司，美国)。蛋白免疫印迹图像分析使用的是Image J software软件。4、实时定量RT-PCR实验:RNA提取用于RNAprep pur用总RNA提取试剂盒进行RNA的细胞提取，或使用Trizol方法，使用2-微克的RNA与SuperscriptⅡ Reverse Transcriptase合成单链。实时PCR实验使用SYBR绿色技术的LightCycler ST300 PCR仪进行。 实验结果:1、CX-5461在尤文肉瘤细胞系细胞增殖与细胞周期上的效应:MTT分析证明在IC50值0.1-0.2μM浓度下CX-5461作用尤文肉瘤细胞72小时后，细胞活性明显减低。流式细胞仪分析显示CX-5461能抑制尤文肉瘤细胞增殖并诱导细胞subG1出现。2、CX-5461诱发尤文肉瘤细胞系产生细胞凋亡:这里我们研究了在CX-5461导致的尤文肉瘤细胞凋亡过程中的作用。SK-ES-1与SK-N-MC细胞CX-5461均可以引起细胞凋亡。3、CX-5461抑制Akt/mTOR信号通路发挥凋亡诱导效应:分析Akt/mTOR的活性可以明确尤文肉瘤细胞经CX-5461介导产生凋亡的分子机制。数据提示CX-5461诱导凋亡在尤文肉瘤细胞中可能经由抑制Akt/mTOR通路完成。 实验结论:1、CX-5461有效抑制尤文肉瘤细胞增殖并通过抑制Akt/mTOR信号轴诱导细胞凋亡。2、我们的观察研究，可能会对选择性Pol抑制剂CX-5461在尤文肉瘤化疗中的应用提供新的见解和帮助。