目的壮药“国虾薄”为葫芦科植物绞股蓝,是临床治疗肺癌用药的主要成分之一,疗效确切,但真正发挥抗肺癌作用的成分不明确,具体作用机制尚不清楚,影响了该药物的进一步开发应用。因此,本论文在壮医理论的指导下,结合现代科技手段,初步探究“国虾薄”总皂苷抗肺癌的作用机制,并寻找“国虾薄”中发挥药效作用的确切成分,以期为从壮药中寻找安全、有效、低毒的非小细胞肺癌治疗药物提供参考。方法1.采用单因素试验法评价乙醇浓度影响,再用正交试验方法探究最佳提取工艺。以国虾薄总皂苷质量浓度为指标,考察多种型号大孔吸附树脂纯化国虾薄总皂苷的吸附及洗脱条件。2.通过48小时划痕实验,观察国虾薄总皂苷含药血清和绞股蓝皂苷LVI对A549肺癌细胞迁移能力的影响。采用Transwell模型,评价绞股蓝皂苷LVI和国虾薄总皂苷含药血清对A549细胞侵袭能力的抑制作用。运用LCMS-IT-TOF对空白血清和含药血清进行比较分析,探究吸收入体发挥真正药效作用的成分。3.建立C57BL/6J小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,选取造模成功的80只C57BL/6小鼠按完全随机设计分为8组,每组10只,即①模型组、②国虾薄总皂苷高剂量组、③中剂量组、④低剂量组、⑤顺铂组、⑥联合组(顺铂+国虾薄总皂苷中剂量)、⑦参一胶囊组、⑧绞股蓝皂苷LVI组。第⑨组为正常组10只。给药期间观察小鼠精神状态、活动情况,毛发饮食大小便等情况,每隔2天监测小鼠的体重和肿瘤体积变化,第21天测体重后取材。摘眼球法取血,常规法取肿瘤组织、脾、胸腺并称重,计算抑瘤率。常规法取出小鼠完整的肺组织,用Bouin氏液染色进行固定。4.由各组小鼠脾脏和胸腺的重量,计算脾指数和胸腺指数。采用酶联免疫吸附(Elisa)法检测各组小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10)的含量。5.运用HE染色法研究各组小鼠肿瘤组织的病理变化。6.小鼠全肺经Bouin氏液固定24 h后,在解剖镜下观察小鼠肺部正反面及肺叶间的转移瘤灶,计算转移率。免疫组化(IHC-P)法检测小鼠肿瘤组织中微血管密度(MVD)、内皮血管生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)的表达情况。Western-blot技术测定小鼠肿瘤组织中VEGF、HIF-1α、 MMP-2、MMP-9蛋白的表达量。Q-PC R技术测定小鼠肿瘤组织VEGF、 HIF-1α、MMP-2、MMP-9 mRNA的转录水平。7.SD大鼠6只,分为2组；其中一组尾静脉注射给予绞股蓝皂苷LVI,另一组灌胃给予绞股蓝皂苷LVI；放置于代谢笼中,分别收集给药前后048h尿样；SPE-C18小柱对尿液样品进行前处理后,运用LCMS-IT-TOF比较分析静脉给药组、口服给药组和空白组尿液中的成分。8.运用分子对接技术(Molecular Docking)模拟绞股蓝皂苷LVI、绞股蓝皂苷XLVI、绞股蓝皂苷L、绞股蓝皂苷LI、达木林A、达木林B与靶蛋白VEGFR-2的结合模式,评价六个皂苷化合物与VEGFR-2的结合能力。结果1.单因素试验结果显示,当浓度为70%时,其得率最高；当乙醇浓度大于70%,随着浓度的增加,其得率却有所下降。故选乙醇浓度为60%、70%和80%来作正交因素的考察,以确定最佳的乙醇提取浓度。正交试验优选的最佳工艺条件为A2B3C1D4,即药材加12倍量70%的乙醇,回流提取3次,每次1 h。静态吸附试验发现,HP-20型大孔树脂对国虾薄总皂苷的吸附量与解吸率均较高,因此选用HP-20型大孔吸附树脂。动态吸附和解吸附试验结果为,最佳吸附质量浓度为6.23-12.47 mg/ml、最佳吸附流量为1 ml/min、先用蒸馏水洗去水溶性杂质,再用20倍柱体积70%乙醇液洗脱,收集70%乙醇洗脱部分。2.作用48 h后,含药血清对A549细胞的迁移呈现一定的抑制作用,并且20%含药血清要比10%含药血清抑制作用更明显。绞股蓝皂苷LVI组几乎没有抑制A549细胞迁移的作用。转移小室结果显示：含药血清组抑制A549肺癌细胞侵袭的作用较强,其抑制效果随着血清浓度的升高而增强；浓度为100 μg/ml的绞股蓝皂苷LVI也表现出一定的抑制A549肺癌细胞侵袭的作用,但作用偏弱。LCMS-IT-TOF比较分析含药血清及空白血清中成分,结果表明,在血清中检测到8.2、9.5、16.2、16.6、21.1和21.7 min处出现的gypenoside LⅥ、gypenoside XLⅥ、gypenoside L、gypenoside LⅠ、达木林B及达木林A,为国虾薄总皂苷口服后消化吸收入血有效成分。3.与模型组相比,其它各给药组小鼠的肿瘤质量均较低,差异具有极显著意义(P<0.01)；低剂量组瘤重与中剂量和高剂量组相比有显著性差异(P<0.05)；中剂量组瘤重与高剂量组相比无显著性差异；参一胶囊组瘤重与高、中剂量组均有显著性差异(P<0.05)；顺铂组和联合组瘤重与其他各组相比有极显著性差异(P<0.01)。各给药组均表现出一定程度的抑制肺癌生长的作用。4.与正常组相比,模型组小鼠的脾指数和胸腺指数显著降低,差异极显著(P<0.01)。顺铂组小鼠的脾指数、胸腺指数分别为(4.62±2.97)mg/g、(0.48±0.15)mg/g,均低于模型组(10.72±1.17,0.69±0.17)mg/g和其他给药组。相对于模型组,国虾薄各剂量组、绞股蓝皂苷LVI组、参一胶囊组的脾指数和胸腺指数增加明显,且均小于正常小鼠相关指数。国虾薄高、中、低剂量组、绞股蓝皂苷LVI组小鼠血清中IL-2的含量分别为(2282.71±283.76)ng/l、(1893.43±208.13)ng/l、(1745.34±110.67)ng/l、(1892.35± 120.34)ng/l,相比于模型组(872.63±172.34)mg/l,IL-2水平明显提高,差异具有显著性(P<0.05)；IL-10含量分别为(683.42±138.74)ng/1、(645.76±255.35)ng/l、(829.48±266.32)ng/l、(755.64±293.28)ng/l,相比于模型组(1182.74±263.78)ng/l、IL-10水平明显降低。5.免疫组化实验结果,7组小鼠肿瘤组织内CD34均有阳性表达,内皮细胞被染成棕黄色,与模型组相比,国虾薄高、中剂量组、绞股蓝皂苷LVI组、参一胶囊组、联合组MVD表达率降低,差异有显著意义(P<0.05)。7组小鼠肿瘤组织VEGF、HIF-1α均以肿瘤细胞质着棕黄色为阳性表达。与模型组相比,国虾薄高、中剂量组、绞股蓝皂苷LVI组、联合组的VEGF、HIF-1 α表达率降低,差异有显著意义(P<0.05)。Western-blot实验结果为,对于VEGF蛋白表达量,参一胶囊组有降低趋势,其他给药组均显著性降低,联合组相对顺铂组和中剂量组降低趋势更明显,表现出一定增效的作用；对于HIF-1 α蛋白表达量,除中剂量组略微增加外,其他各给药组均表现降低趋势,其中绞股蓝皂苷LVI组差异具有显著性。对于MMP-2表达量,与模型组相比,各给药组没有显著性差异,但表现出表达降低的趋势。同样,对于MMP-9表达量,与模型组相比,国虾薄中剂量组降低显著,其他给药组没有显著性差异,但也表现出表达降低的趋势。Q-PCR结果显示,与模型组相比,各给药组小鼠VEGF mRNA表达率降低,差异有显著意义(P<0.05)；各给药组小鼠MMP-2 mRNA表达率降低,联合组和绞股蓝皂苷LVI组差异有显著意义(P<0.05)；各给药组小鼠MMP-9 mRNA表达率降低,高剂量组和联合组差异有显著意义(P<0.05)；各给药组HIF-1α mRNA表达率降低,绞股蓝皂苷LVI组差异有显著意义(P<0.05)。6.口服给药后尿样比空白尿样多出6个色谱峰,静脉给药后尿样比空白尿样多出8个色谱峰。它们为绞股蓝皂苷LVI及其脱糖代谢产物、脱水代谢产物：绞股蓝皂苷XLVI、绞股蓝皂苷L、绞股蓝皂苷LI、达木林A、达木林B、2a-OH-20(S)-ginsenoside Rh2和2α-OH-20(R)-ginsenoside Rh2。7.在对复合物平均构象分析中,发现VEGFR-2活性腔体中五个关键氨基酸Asn923、Asp1046、Leu840、cys919、Glu917可与六个达玛烷皂苷形成不同强度的氢键。结论1.国虾薄总皂苷最佳提取工艺为,药材加12倍量70%的乙醇,回流提取3次,每次1 h。国虾薄总皂苷最佳纯化工艺为,选用HP-20型树脂,最佳吸附质量浓度为6.23～12.47 mg/ml、最佳吸附流量为1 ml/min、先用蒸馏水洗去水溶性杂质,再用20倍柱体积70%乙醇液洗脱,收集70%乙醇洗脱部分。2.国虾薄总皂苷含药血清具有较明显的抑制A549细胞的迁移和侵袭能力,主要为gypenoside L、gypenoside LI、达木林B及达木林A发挥作用。3.国虾薄总皂苷、绞股蓝皂苷LVI可以抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长,改善荷瘤小鼠的一般状况,减小肿瘤体积,增加小鼠体重；国虾薄总皂苷、绞股蓝皂苷LVI可能促进了荷瘤小鼠脾脏和胸腺的发育,增强了小鼠的免疫能力。联合组的脾指数接近模型组,胸腺指数大于模型组,这提示国虾薄联合顺铂给药可能具有一定的增效减毒的作用。血清中IL-2和IL-10含量说明国虾薄总皂苷及绞股蓝皂苷LVI可以促使机体的免疫细胞由Th2向Thl型逆转而发挥抗肿瘤作用。4.国虾薄总皂苷及绞股蓝皂苷LVI可以降低Lewis肺癌细胞肺转移灶数目,降低肿瘤组织中MVD值,其作用机制可能与以下途径有关：一、通过降低肿瘤中HIF-1α的表达,一方面降低肿瘤细胞在缺氧环境中的适应能力,另一方面降低其介导VEGF表达上调的功能；二、直接作用于VEGF,使其表达下调,进而阻止新生血管的生成；三、抑制肿瘤细胞高表达MMP-2和MMP-9,降低其降解基底膜的作用,从而抑制肺癌的侵袭转移。5.六个达玛烷型皂苷均显示出优秀地抑制VEGFR-2的潜力,可以作为先导化合物为进一步设计合成新型的VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂提供参考。