研究背景随着经济的发展及人民生活水平的大幅提高,心脑血管疾病(cardiovascular diseases)成为导致人类死亡的主要疾病之一,严重威胁人类生命健康。作为心脑血管疾病中最常见的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是发生在大中型动脉上的一种慢性进行性病变,其发生的始动因素是内皮细胞功能的损伤。内皮细胞损伤导致血管内皮的完整性遭到破坏,脂质在内膜下的沉积和氧化,激活包括巨噬细胞在内的一系列免疫细胞,诱导粥样斑块的发生。此外,内皮细胞功能损伤可导致内皮细胞凋亡,促进斑块形成,实验亦证实粥样斑块区域内皮细胞凋亡明显增加。所以内皮细胞的完整性和功能活性在阻止动脉粥样硬化疾病的发生进展过程中起重要作用,因此,阻止内皮细胞的功能损伤在预防动脉粥样硬化的发生上其关键作用。引起动脉粥样硬化发生的因素包括环境因素和基因因素,其中氧化应激在动脉粥样硬化中的作用越来越受到重视。氧化应激(Oxidative Stress)反应能引起机体平衡失调,现已被公认为引起动脉粥样硬化的重要因素之一,它能使活性氧(ROS, Reactive Oxygen Species)与抗氧化系统间产生一系列适应性反应。活性氧包括羟基自由基(OH-)、次氯酸盐(OCl-)、超氧阴离子基团(O2-)和非基团氧化物H2O2。内皮细胞对氧化应激异常敏感,活性氧的上调可以损伤血管内皮细胞功能导致血管炎症最终发展成动脉粥样硬化。H2O2可以直接诱导氧化应激产生过多的活性氧以至引起DNA、脂质及蛋白的损伤而导致细胞的凋亡,血管内皮细胞的凋亡可以增加动脉粥样硬化发生率。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与血管内皮细胞氧化还原状态间的失衡会导致血管细胞功能失调,作为MAPK家族成员的Erks. JNKs和P38 MAPK在ROS诱导的应激反应中起重要的协调作用。PI3K/Akt信号通路、FoxO3a及NF-κB信号通路在氧化应激所诱导的内皮细胞凋亡中也起到重要作用。TIPE1 (TNFAIP8L1, TNF-α-induced protein 8-like 1)与TIPE (TNFAIP8)、TIPE2 (TNFAIP8L2)、TIPE3 (TNFAIP8L3)同为肿瘤坏死因子α诱导蛋白8家族(tumor necrosis factor-alpha-induced protein 8 (TNFAIP8) family)成员,这四种成员间拥有大量的同源序列。TIPE是这个家族成员中首先被确认的,含有一个死亡结构域并且调控细胞的生长和凋亡。虽然已有文章报道TIPE1蛋白广泛表达于C57小鼠组织与细胞系中,但有关其功能研究的文章较少,特别是TIPE1在动脉粥样硬化发生中的作用未见报道。因此,本课题以原代培养的人脐静脉内皮为靶细胞,研究在氧化应激时TIPE1对内皮细胞功能的调控作用,并以高脂喂养ApoE-/-小鼠诱导动脉粥样硬化斑块模型观察TIPE1的表达在动脉粥样硬化的发生进展中所起的作用,以期明确TIPE1在动脉粥样硬化发生中的作用并揭示其分子机制。实验方法1.细胞实验研究TIPE1在氧化应激时对血管内皮细胞功能的影响1.1人脐静脉内皮细胞的获取取自齐鲁医院健康新生儿脐带,无菌条件下分离获取脐静脉内皮细胞,M199培养基加10%胎牛血清进行培养,传至第三至第十代的细胞用于实验。1.2氧化应激对内皮细胞表达TIPE1的影响以不同浓度的H202刺激内皮细胞,或者同一浓度刺激不同的时间,收集洗涤细胞提取细胞总RNA,逆转录为cDNA进行实时荧光定量PCR或普通PCR,同时收集H202处理的细胞提取蛋白进行western blot检测TIPE1表达状况。1,3氧化应激时TIPE1对血管内皮细胞功能的影响1.3.1 TIPE1过表达对血管内皮细胞氧化应激时生成ROS及抗氧化酶的影响分别对转染TIPE1表达质粒pRK5-TIPE1及空载体pRK5转染人脐静脉内皮细胞,24小时后,以浓度为100 μmol/L H2O2刺激细胞0、30min,收集细胞以流式细胞仪检测细胞内ROS的生成情况并分析统计结果。H202分别对转染pRK5及pRK5-TIPE1的细胞刺激0、2h后,收集细胞提取总RNA,逆转录后进行实时定量PCR检测抗氧化酶CAT、SOD2、GPX的基因表达情况,并收集H202刺激0、15、30 mmin的细胞,western blot检测转录因子FoxO3a蛋白的活化情况。1.3.2 TIPE1过表达对内皮细胞生长的影响运用CCK-8的方法检测在TIPE1过表达的情况下,细胞的生长情况。1.3.3 TIPE1过表达在氧化应激时对血管内皮细胞死亡的影响TIPE1在过表达的情况下,用H202刺激细胞,分别用台盼蓝染色、AnnexinV/PI的方法检测细胞的死亡情况,细胞周期分析TIPE1过表达对细胞周期分布的影响,与转染pRK5组对比分析结果,得出结论。此外,用western blot检测促凋亡分子caspase3的活化、Bax的表达情况及抑凋亡分子Bcl2的表达情况。1.3.4 TIPE1过表达对内皮细胞摄取ox-LDL的影响在TIPE1过表达的情况下,用ox-LDL刺激内皮细胞,oil-red-O染色,检测其对ox-LDL的摄取情况。1.4干扰TIPE1基因对内皮细胞功能的影响转染TIPE1小干扰RNA及无关对照序列,流式细胞术检测细胞内ROS的生成,CCK-8检测内皮细胞的生长,台盼蓝染色检测细胞的死亡。1.5 TIPE1在氧化应激时对内皮细胞信号通路的影响在TIPE1过表达的情况下,用H202刺激内皮细胞,提取总蛋白,通过western blot方法,检测Akt、MAPK、IκB信号通路的活化情况。2体内实验购自北京科奥协力公司6-8w龄健康雄性ApoE-/-小鼠,分为实验组和对照组,在高脂喂养一周后,分别对两组注射TIPE1慢病毒和对照慢病毒。在高脂喂养8w后,处死小鼠,取其心脏主动脉根部冰冻切片以进行油红O染色和HE染色,腹主动脉以进行大体油红O染色,留取血清检测脂蛋白水平。研究结果1.氧化应激上调内皮细胞表达TIPE1在H202刺激内皮细胞不同时间后,无论其基因水平还是蛋白水平,H202都能促进TIPE1的表达,呈时间和剂量依赖性。2. TIPE1促进H202诱导的活性氧的产生因文献报道H202可以直接引起氧化应激并且产生过多的ROS,因此,在TIPE1过表达的情况下,用H202刺激细胞,流式细胞仪检测细胞内ROS的生成情况以确定TIPE1对H202诱导的ROS产生的影响。结果发现在没有H202刺激的情况下,TIPE1本身就可以促进ROS的产生；H202刺激后,TIPE1过表达的细胞内ROS的浓度大幅度提高。3. TIPE1过表达抑制氧化应激时抗氧化酶的表达TIPE1过表达后,H2O2刺激内皮细胞,检测细胞内过氧化物酶的基因表达情况发现TIPE1有效的降低了CAT、SOD2、GPx基因的表达,FoxO3a的磷酸化活化水平降低,说明TIPE1过表达抑制氧化应激时抗氧化酶的表达。4. TIPE1抑制内皮细胞生长TIPE1过表达后,CCK-8方法检测在H202刺激后不同时间其OD的变化情况,发现TIPE1本身可以抑制细胞生长,而在H202刺激后,TIPE1过表达的细胞其生长增殖速度更低,由此可知,TIPE1在氧化应激时抑制内皮细胞生长。5. TIPE1过表达在氧化应激时促进内皮细胞的死亡5.1台盼蓝染色中TIPE1促进氧化应激诱导的内皮细胞死亡TIPE1过表达后,H202刺激不同时间下用台盼蓝染色发现TIPE1过表达的细胞其死亡率明显增加。5.2 Annexin V/PI中TIPE1在氧化应激时促进内皮细胞的凋亡TIPE1过表达后,H202刺激促进了内皮细胞Annexin V与PI双染所占总细胞的比例,促凋亡分子caspase3的活化及Bax的表达均增高,而抗凋亡蛋白Bc12的显著降低,细胞周期分析发现,H202刺激促进了内皮细胞PI染色所表示的凋亡峰所占各细胞周期的比例,这些结果提示TIPE1过表达促进氧化应激诱导的内皮细胞死亡。6. TIPE1过表达促进内皮细胞对ox-LDL的摄取在TIPE1过表达的情况下,用ox-LDL刺激内皮细胞,油红O染色,检测其ox-LDL吸收情况。发现TIPE1过表达后促进了内皮细胞对ox-LDL的摄取。7. siRNA沉默TIPE1基因对内皮细胞功能的影响在TIPE1基因沉默情况下,FCM检测胞内ROS水平明显低于对照细胞,细胞生长较对照细胞增快,细胞死亡明显低于转染对照无关序列的细胞,由此可进一步说明TIPE1能够促进氧化应激诱导的内皮细胞死亡。8. TIPE1在氧化应激时通过调控Akt、MAPK、IκB信号通路促进内皮细胞的死亡通过western blot检测H202刺激TIPE1过表达的细胞其Akt、MAPK、IκB信号通路活化情况与对照组比较,可以发现TIPE1抑制p-Akt、p-IκB、p-Erk的活化而促进P-P38、p-JNK的活化,以此调控在氧化应激时TIPE1所促进的细胞死亡。9. TIPE1蛋白促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生通过对主动脉根部冰冻切片进行油红O染色及HE染色,以及对腹主动脉进行大体油红染色,结果发现注射高效表达TIPE1蛋白的慢病毒的小鼠体内斑块沉积情况明显较注射对照慢病毒的小鼠严重,TIPE1对小鼠血糖、血清总胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的分泌没有影响,而对甘油三酯和游离脂肪酸的分泌起到促进作用。提示TIPE1可以促进动脉粥样硬化的发生。结论1.动物实验证实TIPE1具有促进动脉粥样硬化效应；2. TIPE1促动脉粥样硬化的机制与TIPE1调控血管内皮细胞的氧化应激效应有关,具体表现为：H202诱导内皮细胞氧化应激时上调TIPE1表达,且呈时间和剂量依赖性；表达的TIPE1蛋白抑制内皮细胞的生长,促进氧化应激诱导的内皮细胞死亡,促进内皮细胞对ox-LDL的摄取；3. TIPE1在氧化应激时通过抑制p-Akt、p-IκB、p-Erk的活化和促进p-P38、p-JNK的活化从而促进内皮细胞死亡；创新点及意义1.首次提出TIPE1促进动脉粥样硬化形成的创新性论断；2.首次研究了TIPE1对血管内皮细胞功能的调控作用,提出TIPE1促进氧化应激诱导的细胞凋亡促动脉粥样硬化形成。