论文部分内容阅读
脂蛋白是由载脂蛋白、脂质及其它少量亚组分构成的于血液中运载脂质的复合体。其中,低密度脂蛋白(LDL)水平升高及高密度脂蛋白(HDL)水平降低是引发动脉粥样硬化及冠心病的重要风险因素。而LDL受体(LDLR)作为肝脏清除血液中LDL的主要受体在控制胆固醇代谢平衡方面发挥着非常重要的作用。人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)在稳定血脂方面起着重要的调节作用。我们及其他人前期的一些研究结果表明,PCSK9通过促进LDLR的降解来调节血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-cholesterol,LDL-C)水平。人类遗传学证据也表明,PCSK9功能增强型的突变体能显著增加冠心病的发病率,而其功能失活性突变体能够降低冠心病的发病率。因此,抑制PCSK9的活性已成为降低LDL-C的新的药物靶点。虽然PCSK9抑制剂已经作为降血脂的药物进行开发,PCSK9促进LDLR降解的细胞内作用机制仍不清楚。深入揭示PCSK9降解LDLR的作用机制不仅能更好的评估PCSK9抑制剂的安全性,同时也有望为开发新的PCSK9抑制剂提供思路。CRISPR/Cas9是当代发展非常迅速的一项基因编辑技术,这种从细菌和古生菌基因组中发现的基因序列间隔重复元件和其相关的酶Cas9可以控制目标DNA的双链断裂。在一段与目标DNA序列相匹配的20bp的sgRNA的引导下,Cas9结合到目标DNA上并催化使其双链断裂,细胞在DNA双链断裂修复过程中引入的移码突变等会导致目标基因的失活,这已经成为研究基因功能的重要手段。而针对全基因组水平的sgRNA文库,也成为在基因组水平筛选功能基因的重要方法。本论文以现有的sgRNA质粒文库为原始材料,扩增了以慢病毒为载体的CRISPR/Cas9-sgRNA表达文库,包装制备了具有良好活性的慢病毒表达文库,通过梯度稀释法测定了慢病毒文库的滴度,并成功应用于针对PCSK9作用机制的全基因组筛选,通过深度测序分析,获得了一些参与调解PCSK9降解LDLR活性的候选基因,为后继实验奠定重要基础。