茶叶厌氧发酵中高含量没食子酸形成以及茶蛋白降解促进活性肽释放的研究

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没食子酸(Gallic acid,GA)具有多种生物活性,茶鲜叶中GA含量较低,仅为0.20~1.00 mg/g。我们课题组发现夏秋茶鲜叶经厌氧发酵所制得的酸茶中GA含量超过20.00 mg/g,然而,形成高含量GA的调控机理尚不清楚。酯型儿茶素,特别是EGCG,水解促进GA的生成已在较多好氧型发酵茶中被报道,但我们发现EGCG在厌氧发酵茶中可能对提高GA含量的贡献不大,这表明厌氧发酵中存在另一条促进GA积累的途径。众所周知,茶叶富含蛋白质,约占干重的20~30%,具有多种生物活性,由于其多数为非水溶性蛋白,营养价值的发挥尚需酶促水解反应成小分子蛋白、多肽或者氨基酸。微生物发酵被认为是降解茶蛋白的一种有效方式,然而,茶蛋白质组在发酵过程中的变化规律及其对多肽和氨基酸释放的影响尚不清楚。为此,本研究选用经厌氧发酵0、6、12、18、24和30天后的酸茶样本,对其进行GA和儿茶素类物质的检测,并基于酸茶代谢组的全面分析筛选转化形成GA的关键前体物;同时,利用微生物组学筛选作用GA形成的关键微生物,并尝试了解作用前体物转化形成GA的微生物源酶蛋白。另一边,借助非标定量蛋白质组学技术对厌氧发酵过程中茶蛋白的变化规律进行解析,了解发酵过程中可能被降解的重要茶蛋白以及促进茶蛋白降解的微生物;此外,对茶叶蛋白降解过程中产生的活性肽,特别是潜在的抗氧化肽,也做了进一步分析。结果可为微生物发酵提高GA含量以及发酵中茶蛋白降解形成多肽的研究提供新知识;同时,利用夏秋茶鲜叶开发富含GA的功能茶产品,为提高我国茶叶资源利用率以及茶产业经济稳定发展提供新思路。主要研究结果如下:(1)经厌氧发酵18天,GA的含量由1.72 mg/g(0 d)显著上升至24.26 mg/g;发酵中GA的提高伴随着ECG、EAG和7-GC含量的显著下降,而EGCG的含量近乎稳定存在于整个发酵过程中。这表明EGCG对GA含量的提高贡献不大,而ECG、EAG和7-GC可能是厌氧发酵中转化形成GA的关键前体物。(2)厌氧发酵中海枣曲霉(A.phoenicis ATCC 13157)和塔宾曲霉(A.tubingensis strain CBS 134.48)分泌的羧酸酯酶可能是促使ECG、EAG和7-GC转化形成GA的驱动力。(3)细菌源的GA是厌氧发酵中高含量GA形成的另一途径,其中芽孢杆菌(Bacillus)等细菌被认为是生产GA的关键微生物。(4)茶叶蛋白在厌氧发酵中存在一个缓慢降解的过程,中高丰度的亲水性茶蛋白可能是首先被降解的目标蛋白,例如tubulin和rubisco家族以及一些调控植物生理代谢相关的酶蛋白。(5)厌氧发酵中乳杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和希瓦氏菌属(Shewanella)等细菌自身活跃的生理代谢以及来自曲霉属的水解酶类可能共同促进了茶蛋白的降解。(6)厌氧发酵是一个酸度和氨基酸总量(FAAs)逐渐上升的过程,常见的18种游离氨基酸对FAAs的增加贡献不大,而大量的短肽被释放可能是引起酸茶中FAAs被增加的主要原因。(7)26个短肽被预测具有潜在的抗氧化活性,其中7个潜在的抗氧化肽(I L W、W L R、W Y、Y V、E L W、F Y和P Y V)被认为是提高酸茶抗氧化能力(DPPH和羟自由基清除力)的关键肽。茶叶中某些可溶性蛋白的降解,特别是参与植物代谢调控的酶蛋白—tubulin和rubisco家族蛋白,可能是释放这些潜在抗氧化肽的关键茶蛋白。
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