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目的:表面机械研磨处理(surface mechanical attrition treatment,SMAT)技术是使用高频率弹丸反复冲击试样表面,从而材料的表面会产生塑性变形,实现晶粒的细化,得到从表层到基体晶粒尺寸由小到大的梯度分布组织。由于不存在表层与基体间的界面连接问题,从根本上解决了其表面纳米结构层与基体易剥离的界面结合力差的问题。此外,纳米结构层影响了材料表面细胞的生长环境。其吸收氢的能力显著提高,并且显示出良好的储氢可逆性,促进表面活化。随着表面活化能的增加,对钙磷离子的吸附能力增强,亲水性增强,蛋白质吸附量增加。并且纳米结构表面会减少成骨细胞以外的其他类型细胞的黏附,特别是成纤维细胞。而且,纳米结构表面还可以抑制细菌的黏附。所以,SMAT处理后的材料表面可以促进细胞的增殖、粘附及成骨向分化,提高材料的骨整合能力。环状RNA(circlular RNA,circRNA)可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)通过微小RNA(microRNA,mi RNA)应答元件(microRNA response elements,MRE)与miRNA结合,从而降低miRNA对信使RNA(messenger RNA,mRNA)的剪切、降解或抑制其转录翻译的作用。近年来大量研究表明,circRNA可以调控干细胞成骨分化。通过本实验探究SMAT钛对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成骨分化的影响。探讨其中机制,并验证SMAT钛对hBMSCs成骨诱导过程中circRNA的表达影响。研究方法:1.材料制备:采用SMAT技术处理医用金属纯钛板,并获得表层晶粒尺寸为纳米级的梯度纳米金属纯钛材料。电火花切割成直径11mm、20mm,高2.5mm的实验组梯度纳米金属纯钛钛片。对照组经SMAT处理后再进行退火处理,从而其晶粒长大,得到表面粗糙度相似的退火(annealed)金属纯钛钛片。材料处理:丙酮、36%-38%稀盐酸、无水乙醇、蒸馏水依次超声荡洗20分钟,干燥,高温高压灭菌后备用。采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察实验组材料表面是否形成了纳米结构。2.在无菌操作下,在材料表面培养hBMSCs。采用CCK-8(cell counting kits-8)法检测hBMSCs的增殖情况并绘制hBMSCs的增殖曲线。3.采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测法分析各组材料对hBMSCs成骨分化的影响。4.采用茜素红染色法分析各组材料对hBMSCs成骨分化的影响。5.应用生物信息预测软件miwalk3.0,通过与成骨相关的mRNAs进行miRNAs和circRNAs的预测。构建circRNA-miRNA-mRNA网络,分析它们之间的相互作用,选3-5个位于网络关键位置的候选circRNAs进行验证。通过定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)技术对各组hBMSCs的候选circRNAs的表达情况进行检测。6.使用SPSS Statistics 20.0软件和Graphpad Prism 7进行统计分析实验数据。结果:1.TEM观察显示,SMAT方法可以使材料表面纳米化,其经理尺寸是纳米级别。2.CCK-8结果:hBMSCs生长曲线近似“S”形。传代培养后的潜伏期为1-3天,对数增殖期为第3-5天,5天时细胞数目达到峰值,随后进入平台期。在培养的第3、5天时,SMAT钛组与退火钛组相比,差异具有统计学意义。3.ALP活性检测结果:hBMSCs经成骨诱导培养3、5、7、14天时,各组的ALP活性均随着时间的延长而增高。在各个时间点,SMAT钛组ALP活性均高于退火钛组。在第3、5天时,SMAT钛组与退火钛组的差异具有统计学意义。4.茜素红染色结果:hBMSCs经成骨诱导培养7、14、21天时,各组的茜素红染色面积均随着时间的延长而增加。在各个时间点,SMAT钛组茜素红染色面积均大于退火钛组。5.生物信息预测结果:根据20个成骨相关mRNAs预测出成骨相关的miRNAs8个、circRNAs 51个。其中30个circRNAs和8个miRNAs构成6个circRNA-miRNA-mRNA网络。选择circ-LTBP2作为候选circRNA。QRT-PCR检测结果表明,与对照组相比,实验组hsa＿circ＿0032599、hsa＿circ＿0032600、hsa＿circ0032601表达量上调,其中hsa＿circ＿0032600表达差异最明显且在第14天具有统计学意义(fold change/FC=4.25,P<0.05)。结论:1.SMAT钛材料相对于退火钛材料具有更好的促进hBMSCs成骨分化的能力。2.SMAT钛材料可以通过影响circRNA促进hBMSCs成骨分化。