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动物细菌性传染病限制着畜牧业的发展,同时给人类健康带来了潜在的威胁。抗生素的出现,在一定程度上拯救了受病原菌危害的动物,给人类也带来了益处。然而,由于不合理的使用抗生素,病原菌逐渐产生了抗生素耐药性（AMR）,其中细菌多重耐药性（MDR）使一些细菌性疾病的治疗陷入无药可用的困境。多重耐药的病原菌主要依赖于I类整合子介导的抗性基因水平转移而获得抗性,而I类整合子的功能主要依靠整合酶IntI-1蛋白介导。已知NgAgo蛋白是一种内切核酸酶,由N端、PAZ、MID、PIWI四个结构域组成,酶活性中心存在于PIWI结构域中。本实验室之前的研究表明,NgAgo能通过PIWI结构域与RecA互作而增强RecA介导同源DNA链交换的能力,提高同源重组效率,并且其功能不依赖NgAgo核酸酶活性。对实验室前期NgAgo蛋白互作分子的质谱数据进行分析时,发现了整合酶IntI-1蛋白是NgAgo蛋白的互作分子,类比NgAgo蛋白与RecA蛋白互作及效应的研究结果,提示着NgAgo蛋白可能通过与IntI-1蛋白相互作用影响IntI-1蛋白介导的DNA重组效率,进而在整合子介导细菌耐药的过程中发挥一定的效应。基于此,本论文主要研究了 NgAgo蛋白与IntI-1蛋白的互作及对其结合靶DNA序列的抑制效应,为解析细菌耐药的机制及NgAgo蛋白在细菌耐药中的作用奠定基础,其研究内容如下:1)为了验证NgAgo蛋白和IntI-1蛋白存在互作,本研究首先构建了融合FLAG标签的NgAgo蛋白表达质粒——pET28a-NgAgo-FLAG,合成了 His标签的Inti-1蛋白表达质粒——pBAD-IntI-1-His,然后将两个质粒共同转化至BL21菌株中,并诱导NgAgo蛋白和Inti-1蛋白共表达,利用FLAG抗体树脂和NTA树脂对共表达菌株的破碎样上清进行正反垂钓实验,验证了 NgAgo蛋白与IntI-1蛋白互作。本实验进一步探究NgAgo蛋白与IntI-1蛋白是直接互作的,还是通过同时结合到基因组DNA上而间接互作的。本实验证明DNase I能消化基因组DNA,将DNase I加入NgAgo蛋白和IntI-1蛋白共表达的菌体破碎样上清中处理1h,利用FLAG抗体树脂进行垂钓实验,发现NgAgo蛋白和IntI-1蛋白仍然存在互作,说明NgAgo蛋白和IntI-1蛋白不受DNase I的影响,暗示两者互作可能是直接的。2)为进一步分析NgAgo蛋白的四个结构域和酶活性在NgAgo蛋白与IntI-1蛋白互作中所起的作用,首先构建了融合FLAG标签的不同NgAgo结构域蛋白表达质粒:pET28a-NgAgoA-FLAG（N 端）、pET28a-NgAgoB-FLAG（PAZ-MID-PIWI 域）、pET28a-NgAgoD-FLAG（MID-PIWI 域）、pET28a-NgAgoD-M-FLAG（酶活性位点突变的 MID-PIWI 域）、pET28a-NgAgoE-FLAG（MID 域）、pET28a-NgAgoF-FLAG（PIWI域）,和融合GST标签的IntI-1蛋白表达质粒——pGEX-6P-1-IntI-1-GST,将不同NgAgo结构域蛋白表达质粒分别和IntI-1蛋白表达质粒共转至BL21菌株中并诱导表达,利用FLAG抗体树脂和GST树脂对共表达菌株的破碎样上清进行垂钓实验。垂钓结果表明IntI-1蛋白和NgAgoB、NgAgoD、NgAgoF三个蛋白互作,而不和NgAgoA、NgAgoE蛋白互作,说明PIWI结构域是NgAgo蛋白与IntI-1蛋白互作的关键结构域;垂钓结果还表明NgAgoD-M蛋白也与IntI-1蛋白互作,而NgAgoD-M蛋白是突变了 PIWI结构域酶活性位点的无核酸酶活性NgAgo截短蛋白,说明NgAgo蛋白的核酸酶活性不影响NgAgo蛋白与IntI-1蛋白的互作。另外,为进一步验证NgAgo截短蛋白和IntI-1蛋白互作是否也不依赖基因组DNA,本实验选取了 NgAgoD蛋白进行实验,GST树脂垂钓结果表明NgAgoD和IntI-1蛋白的互作也不受DNase I的影响,暗示NgAgoD蛋白与IntI-1蛋白的互作也可能是直接的。3)已知,IntI-1蛋白具有结合靶DNA序列的能力,为进一步探究NgAgoD-M蛋白对IntI-1蛋白结合靶DNA序列的影响,本实验合成了 IntI-1蛋白已知的靶DNA序列—attI-dsDNA片段、无关DNA序列—aadAI-attc dsDNA片段,并体外纯化了重组蛋白IntI-1和NgAgoD-M;通过凝胶迁移实验验证了 IntI-1蛋白结合靶DNA序列,不结合无关DNA序列,证明了该实验条件的可行性;进一步的凝胶迁移实验结果表明NgAgoD-M蛋白具有能够抑制IntI-1蛋白结合靶DNA序列的能力。4)因为整合酶IntI-1蛋白和λInt蛋白同属酪氨酸重组酶家族,所以本研究在表达NgAgo、NgAgoD蛋白的K12菌中加入一定滴度的λ噬菌体,测定了菌株的生长曲线,并计算了菌株形成噬菌斑的数目,以此来探究NgAgo蛋白对λ噬菌体中λInt蛋白结合靶DNA序列而介导的同源重组效率的影响。已知λ噬菌体侵染宿主菌的生理过程在一定程度上代表着λInt蛋白介导DNA重组的效率。生长曲线的结果表明添加λ噬菌体后,NgAgo、NgAgoD蛋白的K12菌株组与对照组的生长周期不存在显著差异;噬菌斑实验结果表明,表达NgAgo、NgAgoD蛋白的K12菌株组与对照组相比,噬菌斑数目没有统计学上差异。因此,本实验未能判定NgAgo、NgAgoD蛋白能够影响λInt蛋白结合靶DNA序列而介导的DNA重组效率,暗示着NgAgo蛋白和λInt蛋白可能不互作,而只与IntI-1蛋白互作。总的来说,本研究结果表明,NgAgo蛋白能够通过PIWI结构域与IntI-1蛋白互作,并具有抑制Inti-1蛋白结合靶DNA序列的能力。