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研究背景及目的:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,非特殊型浸润性癌(Non-specific type of invasive carcinoma),是浸润性乳腺癌最常见的组织学类型,占40-70%左右。研究发现,缺氧微环境是实体肿瘤的典型特征,被认为是导致肿瘤进展及预后差的始动因素,为了适应缺氧的微环境,肿瘤细胞会产生一系列生物学行为的改变,其中缺氧诱导因子(hypoxia induced factors,HIFs)发挥着重要的调节作用。目前已发现HIFs有三个亚型:HIF-1α、HIF-2α以及HIF-3α,以往的研究主要集中在HIF-1α,主要是HIF-1α与乳腺癌血管生成、肿瘤增殖与转移、耐药相关蛋白等方面,HIF-2α的研究相对较少。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指由非移动的、极性排列的上皮细胞向移动的、非极性排列的间质细胞转变,同时获得向远处器官迁移、生长、种植的潜能的过程。在恶性肿瘤可导致肿瘤细胞迁移和侵袭能力增强,肿瘤侵袭性增加。HIF-2α是缺氧应激作用下产生的转录因子,其表达可以有效调控靶基因活性打破细胞内氧失衡状态,比如新生血管形成基因(CEGF、PIGF)、增殖转移基因(MMP、SDF1、CXCR4、LOX)、上皮间质转化(SNAIL、TWIST、SIP)等,有助于新生血管生成的维持,也可以对肿瘤的浸润转移产生影响。研究发现,HIF-2α的异常表达参与肿瘤放化疗抵抗,提示HIF-2α与肿瘤的不良预后有关,HIF-2α有可能成为肿瘤治疗的靶点。Twist家族是HIF-2α众多调控基因中的一个,Twist2也称为Dermo1,是参与调控上皮间质转化的主要转录因子,可以诱导肿瘤细胞EMT的过程进而利于其迁徙、侵袭、转移。乳腺浸润性癌发生上皮间质转化一定程度上决定了肿瘤转移,提升了死亡率缩短了生存期,严重影响患者预后。目前有关乳腺癌组织中HIF-2α与上皮间质转化关系的报道较少,本课题以乳腺非特殊型浸润性癌为研究对象,采用免疫组织化学SP法和原位杂交(ISH)技术分别检测乳腺浸润性癌原发灶、良性纤维腺瘤、癌旁正常组织中HIF-2α蛋白和mRNA的表达情况,同时检测癌组织中Twist2、E-cadherin以及vimentin的表达,探讨HIF-2α与上皮间质转化是否存在关联,并分析HIF-2α对乳腺癌预后的影响因素,为HIF-2α是否可以作为乳腺癌临床治疗的靶点提供实验依据。方法:1.收集2011年8月-2012年1月乳腺非特殊型浸润性癌石蜡标本92例、癌旁正常组织30例、纤维腺瘤21例,采用免疫组化SP法检测各组中HIF-2α、Twist2、E-cadherin、vimentin蛋白的表达,分别分析其表达与临床病理参数的相关性以及他们之间的关联。2.收集2015-2016年乳腺非特殊型浸润性癌石蜡标本22例、癌旁正常组织20例、纤维腺瘤20例,采用原位杂交方法检测组织切片中HIF-2αmRNA的表达情况,从基因水平检测其表达在乳腺癌中的差异。3.对92例乳腺癌进行随访,采用Kapln-Meier法和Log-rank检验进行生存分析,多因素Cox比例回归模型分析乳腺癌预后的影响因素。结果:1.HIF-2α蛋白在92例乳腺癌、21例纤维腺瘤和30例癌旁正常组织中阳性率分别为71.73%(66/92)、42.85%(9/21)和36.66%(11/30),HIF-2αmRNA在22例乳腺癌、20例纤维腺瘤和20例癌旁正常组织中阳性率分别为77.27%(17/22)、25.00%(5/20)和15.00%(3/20),HIF-2α蛋白以及mRNA在这三组中的表达均呈现一致性,很明显看出,阳性表达较高的是乳腺癌组(P均<0.05)。HIF-2α蛋白阳性表达与肿瘤大小、淋巴结转移、分子分型有关(P<0.05),与患者年龄(P=0.921)、组织学分级(P=0.566)、TNM分期(P=0.209)均无关。2.Twist2蛋白在92例乳腺癌、21例纤维腺瘤和30例癌旁正常组织中阳性率分别为57.60%(53/92)、19.04%(4/21)和16.66%(5/30),且三组之间的不同表达有统计学意义(P<0.05);Twist2蛋白的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移和分子分型有关(P<0.05),与患者年龄(P=0.915)、肿瘤大小(P=0.736)、TNM分期(P=0.757)均无关。3.上皮标志物E-cadherin在乳腺癌组阳性率58.69%(54/92)低于腺瘤组85.71%(18/21)和癌旁正常组93.33%(28/30),其表达与肿瘤的大小、组织学分级、淋巴结转移和分子分型有关(P<0.05),与患者年龄(P=0.615)、TNM分期(P=1.000)均无关。间质标志物vimentin在乳腺癌组阳性率46.73%(43/92)高于腺瘤组23.83%(5/21)和正常组13.33%(4/30),其表达与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期和分子分型有关(P<0.05),与患者年龄(P=0.724)、肿瘤大小(P=0.970)、组织学分级(P=0.129)均无关。4.对乳腺癌组织进行检测后发现,蛋白HIF-2α和Twist2的表达是存在正相关的(r=0.452,P=0.000),而上皮以及间质两标志物之间的表达存在显著负相关(r=-0.570,P=0.000),HIF-2α和Twist2蛋白的表达均与E-cadherin负相关,与vimentin正相关(P均<0.05)。5.HIF-2α阴性组、Twist2阴性组、E-cadherin阳性组和vimentin阴性组分别比其另一组拥有更高的总生存率和更长的平均生存时间,但只有HIF-2α组和E-cadherin组K-M生存曲线差异存在统计学意义(P<0.05),Twist2组和vimentin组K-M生存曲线不存在统计学差异(P>0.05)。6.多因素生存分析显示只有淋巴结转移(RR=6.022,95%CI 2.852~12.717,P=0.000)、肿瘤大小(RR=2.621,95%CI 1.123~6.117,P=0.026)和HIF-2α状态(RR=3.821,95%CI 1.092~13.372,P=0.036)可以作为乳腺癌患者生存预后的独立影响因素(P<0.05),而其他预后指标,比如年龄、组织学分级、TNM分期、分子分型等均为乳腺癌的非独立预后因素(P>0.05)。结论:HIF-2α在乳腺癌中异常表达,可能通过介导Twist2参与到乳腺癌EMT过程中,引起了肿瘤的浸润转移并影响生存预后。