第一部分:人APOBEC3G基因的克隆与真核表达目的建立宿主固有抗HIV-1因子载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like 3G,APOBEC3G,hA3G)的真核表达体系。方法采用反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)中获取hA3G基因编码区,将其连接入T载体,测序验证后再克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,然后将重组质粒pEGFP-N1-A3G转染HEK293T细胞,分别用RT-PCR法和蛋白印迹法(Western Blot)验证融合蛋白hA3G-EGFP在mRNA和蛋白水平的表达。结果克隆获得hA3G基因编码区长1 154 bp,测序结果与GenBank中hA3G参考序列(NM021822)比对发现存在两处差异,分别位于mRNA第588位和746位碱基处。重组质粒pEGFP-N1-A3G转染HEK293T细胞,在荧光显微镜下观察到了绿色荧光,并分别用RT-PCR法和Western Blot法验证了目的基因hA3G在mRNA和蛋白水平的表达。结论成功建立了人固有免疫物质hA3G的真核表达体系,为进一步研究其在HIV-1感染中的作用奠定了基础。第二部分:HIV-1感染者PBMC中APOBEC3G/B/F基因表达水平及其与CD4计数的相关性研究目的人胞嘧啶脱氨基酶家族(hAPOBEC3,hA3)是近年来被发现的机体固有免疫物质,其中成员hA3G、hA3B和hA3F均在体外被证实具有抗Vif缺陷型HIV-1复制的作用,另外hA3B对野生型HIV-1亦具有抑制活性。本研究定量分析HIV-1感染者外周血单个核细胞(PBMC)中hA3G、hA3B和hA3F的mRNA表达水平,并进一步分析它们与CD4~+T细胞计数的相关性,以阐明它们的表达水平与临床疾病进展的关系。方法收集未接受和已接受抗病毒治疗的HIV-1感染者(各21例)以及HIV-1阴性正常人(10例)外周静脉血标本,采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC,TRIzol法抽提总RNA,然后反转录合成cDNA。用实时荧光定量PCR的方法对hA3G、hA3B和hA3F的基因表达水平进行相对定量分析,用流式细胞仪检测CD4~+T细胞计数。结果无论是未接受还是已接受抗病毒治疗的HIV-1感染者,其hA3G、hA3B和hA3F mRNA水平与CD4~+T计数均不具有相关性;HIV-1感染者hA3G mRNA水平低于正常人(P＜0.05),但未治疗与已治疗者相比不存在统计学差异(P＞0.05);hA3B及hA3F基因表达水平在三组人群间比较均存在显著性差异:未治疗HIV-1感染者＜已治疗HIV-1感染者＜正常人(P＜0.05);已治疗HIV-1感染者和正常人的三种APOBEC3家族成员hA3G、hA3B和hA3F的mRNA表达水平具有正相关性,而在未治疗HIV-1感染者三者无此相关性。结论hA3G、hA3B和hA3F基因表达水平与HIV-1感染疾病进展无直接相关性。HIV-1感染可导致PBMC中hA3G、hA3B和hA3F的表达水平降低,经抗病毒治疗抑制HIV-1复制后,hA3B和hA3F的表达上调。HIV-1在复制状态不同的情况下,对PBMC中hA3G、hA3B和hA3F的表达影响程度可能不同,从而导致三者表达水平在未治疗HIV-1者中不再具有正相关性。