茶起源于中国,为我国传统的重要经济作物,是21世纪的健康饮料.茶叶中含有茶多酚、茶氨酸和咖啡碱等多种功能活性成分,因此使茶叶具有抗氧化、防衰老、防癌抗癌等保健功能.咖啡碱是传统茶叶中的主要生物碱,具有兴奋中枢神经、强心活血、利尿等药理作用,但容易引起心悸、失眠、焦虑等不良反应,尤其不适合神经衰弱者、心血管疾病患者和孕妇等特殊人群饮用.世界珍稀茶树资源--南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla Chang)以3％～6％的可可碱含量取代传统茶叶中2％～5％的咖啡碱含量,可避免咖啡碱引起的不良反应,但保留了传统茶叶中其它的保健功效.N-甲基转移酶(N-methyltransferase,NMT)是茶树、咖啡等植物中咖啡碱合成的关键酶类,在以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体下催化黄嘌呤核苷在N7、N3和N1位转甲基生成咖啡碱,因此开展对NMT基因及其特性的研究是茶叶咖啡碱代谢机理研究的基础。 本研究以南昆山毛叶茶为主要研究材料,在大量分析南昆山毛叶茶单株中咖啡碱、可可碱和茶碱含量的基础上,对部分低咖啡碱单株进行了系统的理化成分分析;以低咖啡碱南昆山毛叶茶春季嫩稍为材料,成功构建了南昆山毛叶茶cDNA文库;通过同源探针杂交筛选南昆山毛叶茶cDNA文库,克隆获得了系列咖啡碱合成过程关键酶--NMT基因,并对其中2个全长基因进行了原核表达和功能鉴定;分析了NMT基因在茶树体内的表达特性,为深入研究南昆山毛叶茶以可可碱为主的生物碱代谢分子机理提供了科学依据。本文主要研究结果如下: (1)采用HPLC法分析了394棵南昆山毛叶茶咖啡碱、可可碱和茶碱含量,筛选出350棵低咖啡碱(<0.01％)含量的单株;选取10株低咖啡碱含量单株,分析了三碱含量的年度和季节动态变化,发现其不含咖啡碱的代谢特性不随年份和季节的改变而改变;对南昆山毛叶茶茶多酚、游离氨基酸等常规成分分析后发现,其体内茶多酚含量平均为40.3％,比英红九号高约10％,但儿茶素单体含量占茶多酚总量的比例仅为32.89％,远低于英红九号将近60％的比例;南昆山毛叶茶儿茶素单体中DL-C和GCG的含量高,其中GCG的含量是英红九号的3.9倍多;南昆山毛叶茶中茶叶特征氨基酸--茶氨酸平均含量为0.42％,个体之间差异明显. (2)通过不同方法的比较研究,获得了适合南昆山毛叶茶这一高茶多酚、高花青素含量的特殊资源、同时也广泛适用于其他茶树品种的RNA高效提取方法--CTAB-LiCl沉淀法。在此基础上利用ZAP试剂盒法成功构建了南昆山毛叶茶cDNA文库,原始文库滴度为6.0×1 05pfu/mL,重组率为97.3％,插入片段大小在1.0kb～2.0kb之间的占整个文库的70％左右,完全符合一个高质量cDNA文库的要求.文库经扩增后滴度为1.9×109pfu/mL,重组率达到99.1％. (3)利用同源探针杂交筛选的方法从南昆山毛叶茶cDNA文库中分离获得了33个与探针高度同源的阳性克隆.序列分析后发现其中2个为全长基因,分别命名为NMT5和NMT7,编码区长1071bp和1098bp,分别编码356和365个氨基酸,与已登录NCBI的来自茶叶的NMT基因同源性高达99％;一个序列长1555bp,没有完整的ORF框,其中723个连续碱基序列与已报道的茶叶NMT基因同源性高达99％,序列其他部分则同源性不高;其他序列为与已知序列(包括NMT5,NMT7和已登录的茶树NMT基因)同源性高达95％以上的基因片段. (4)以pET32a(+)为表达载体,成功构建了南昆山毛叶茶NMT5和NMT7以及来自英红九号的YHCS三个NMT基因的表达载体.通过对不同诱导温度、不同诱导剂浓度和不同时间三个诱导条件的优化,最终确定各载体的最佳条件为:pET32a-NMT5和pET32a-NMT7,37℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导6h:pET32a-YHCS,37℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导4h. (5)通过对pET32a.NMT5和pET32a-NMT7表达的融合蛋白进行体外酶促催化不同嘌呤生物碱底物后发现,pET32a-NMT7表达的融合蛋白具有催化7-甲基黄嘌呤N3位转甲基生成可可碱的活性;而pET32a-NMT5表达的融合蛋白没有检测到催化活性. (6)以本课题组先期获得的NMT1为探针,通过Northern杂交对南昆山毛叶茶和英红九号的NMT基因进行表达分析,结果发现两个茶树品种NMT基因具有相似的表达规律:春、夏两季中NMT基因都有表达,且春季高于夏季,秋季没有检测到杂交信号;从不同叶位来看,NMT基因表达:芽头>第一叶>第二叶>第三叶. 上述研究结果为南昆山毛叶茶可可碱为主的代谢机理研究提供了科学依据,同时也为茶树功能基因研究奠定了坚实基础。