支气管败血波氏杆菌是一种革兰氏阴性菌,能长期或终生感染哺乳动物的呼吸道,引起猪萎缩性鼻炎、犬窝咳、兔鼻塞等呼吸系统疾病。生物被膜能够增强细菌对外界环境的抵抗力,逃避宿主的免疫防御机制;在感染部位不易被清除,导致宿主的持续性感染;而且能够抵制抗生素的作用,使膜内微生物耐药性增加一千倍;据统计约80%以上的细菌性疾病过程中细菌是以生物被膜状态存在的,但是对于生物被膜的形成机制在国内外尚无统一明确的认识,有待进一步深入研究,同时也没有从生物被膜的层面去挖掘更有价值的保护性抗原,因此,通过优化该菌的生物被膜形成条件,确定生物被膜形成的最佳条件并观察其被膜结构,而后应用比较蛋白组学从蛋白水平揭示生物被膜的形成机制,并对相关蛋白的特性进行研究,为生物被膜的形成机制以及疫苗的开发提供科学依据。1猪支气管败血波氏杆菌生物被膜的体外优化及结构观察为确定影响支气管败血波氏杆菌生物被膜的形成条件,本研究采用体外定性与定量两种方法对1株猪源支气管败血波氏杆菌在不同条件下(时间、氯化钠浓度、pH、葡萄糖、蔗糖、乳糖)产生的生物被膜的差异进行了研究,同时对生物被膜的结构进行观察。结果发现24 h为支气管败血波氏杆菌生物被膜成熟稳定期,氯化钠浓度超过0.4%后,生物被膜形成量逐渐下降,培养基pH略偏碱性时有利于支气管败血波氏杆菌生物被膜的生长,乳糖能够促进支气管败血波氏杆菌生物被膜的生成。显微镜观察到24 h后网格状的生物被膜已经形成,并且趋于稳定。2猪支气管败血波氏杆菌生物被膜态和浮游态比较蛋白组学分析本试验通过双向电泳比较了支气管败血波氏杆菌处于生物被膜态和浮游态下全菌蛋白的表达差异,结果发现在生物被膜态的全菌蛋白中,有15个蛋白点表达上调,9个蛋白点表达下调。选取7个上调的蛋白点进行质谱鉴定,发现上调的蛋白点主要有延伸因子、超氧化物歧化酶、分子伴侣等,功能主要体现在应激,调控,代谢方面。该结果从蛋白质水平上深化了对细菌生物被膜形成机制的研究,并为生物被膜的防控和深入研究提供科学依据。3超氧化物歧化酶(SOD)基因的克隆表达及生物学特性研究为探讨猪源支气管败血波氏杆菌超氧化物歧化酶的生物学特性,本研究参照GenBank中RB50株的SOD基因序列设计引物,通过PCR扩增技术获得SOD基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-SOD,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达纯化目的蛋白并测定其酶比活性,免疫小鼠,进行攻毒试验检测其免疫保护效率,并研究了多抗对生物被膜的抑制作用;结果发现重组蛋白以上清的形式表达,其酶比活性为1272(u/mgprot),对小鼠的免疫保护效率为20%,SOD多抗对生物被膜具有一定的抑制作用。