弹状病毒属于单链负义RNA病毒,能够侵染脊椎动物,无脊髓动物以及植物等寄主,能对人类健康、粮食安全和生态系统造成严重威胁。弹状病毒的转录和复制由病毒的核衣壳蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、大聚合酶蛋白(large polymerase protein, L)和病毒基因组组成的复合体共同作用完成。虽然许多动物弹状病毒转录和复制的调控因子己被报道,但具体的转录和复制转换机制尚不清楚,并且由于植物弹状病毒侵染性克隆的缺乏,其P蛋白的功能更是知之甚少。大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV)是一种世界范围内广泛分布的植物细胞质弹状病毒,近期在我国北方小麦产区检测到该病毒病害的发生,说明BYSMV已经传入我国并造成危害。本论文以BYSMV为研究材料,首先利用sRNA拼接技术、RT-PCR以及RACE等方法首次测定了 BYSMV全长基因组及其各个蛋白的mRNAs序列。BYSMV全长12706 nt,能够转录9条mRNA,可以编码10个蛋白,其中5个结构蛋白和5个辅助蛋白。其中P mRNA后面的第二条mRNA含有两个不同相位的重叠编码框ORF4和ORF5,利用体外翻译实验证明了编码框ORF5编码的小疏水蛋白是通过核糖体渗漏扫描的方式从ORF4/ORF5 mRNA翻译出来的。序列比对表明BYSMV和同属的北方禾谷花叶病毒(Northern cereal mosaic virus,NCMV)具有相似的基因组结构和较高的结构蛋白序列相似性,说明它们的亲缘关系比较近。以全长序列信息为基础,在本生烟上通过注射农杆菌,瞬时表达病毒的N、P、L、微型复制子(minireplicon,MR)以及其他病毒编码的基因沉默抑制子,成功构建了负链MR系统(genomic-senceminireplicon,gMR)和正链 MR 系统(antigenomic-senceminireplicon,agMR),并且发现gMR系统在本生烟中复制和转录效率远远低于agMR系统。利用gMR和agMR的反向遗传学系统可以研究BYSMV转录和复制过程中的关键的病毒或寄主因子的功能。在检测MR系统蛋白表达时发现,BYSMVP蛋白在电泳实验中存在迁移率不同的两条带,分别为42 kDa (P42)和44 kDa (P44)两种形式。通过磷酸酶处理分析,P42和P44分别代表P蛋白的基础磷酸化和超磷酸化形式。通过对P蛋白的质谱鉴定,发现了 17个能被磷酸化修饰的位点,其中有5个丝氨酸残基(S189、S191、S194、S195和S198)位于P蛋白固有无序区域的丝氨酸聚集区(serine-rich region, SR)。利用gMR和agMR系统,研究SR区的磷酸化位点的突变对转录和复制的影响,通过对转录和复制产物进行定量检测,发现P蛋白SR区非磷酸化突变体pS5A为P42形式,能够增强MR的复制并减弱MR的转录;P蛋白SR区模拟磷酸化突变体ps5D为P44形式,能够增强MR的转录并减弱MR的复制,该结果表明BYSMVP蛋白SR区的磷酸化状态调控了病毒转录与复制的转换过程。进一步通过co-IP和BiFC实验分析,pS5A和ps5D不影响正常自身互作,也能够与无RNA结合的No互作。但是,ps5A与L蛋白的互作能力减弱,而ps5D与N-RNA的互作能力减弱,表明P蛋白SR区磷酸化修饰影响了 P蛋白在转录和复制过程中形成的复合体功能。综上所述,BYSMV P蛋白SR区的磷酸化状态影响P蛋白的构象,从而改变P与L以及N-RNA组成的复合体的功能,最终调控了病毒转录与复制的转换。此结果为P蛋白参与转录和复制的转换调控提供了新的证据。