研究背景:钙(Ca²⁺)稳态是维持哺乳动物细胞内环境稳态的一个重要方面。正常状态下,细胞内Ca²⁺浓度被精确调节以保持其稳定水平。然而,骨骼肌废用（如航天飞行、去负荷和制动等）会导致细胞内钙稳态紊乱,主要表现为胞浆钙超载。Ca²⁺超载可以激活钙蛋白酶（calpains）,进而使肌丝降解并启动蛋白水解途径（如如泛素-蛋白酶体途径）。钙蛋白酶引发的蛋白质降解增加被认为是诱发废用性肌肉萎缩最重要的途径之一。冬眠是动物在低环境温度和食物稀缺状态下生存的重要策略之一。在长时间的冬眠不活跃状态下,许多冬眠动物如达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）避免了肌肉质量和力量的显著丢失,从而为研究预防废用性骨骼肌萎缩提供了一个天然动物模型。并且在经历数月之久的不活动后,不同类型的骨骼肌纤维均未发生胞浆钙超载。显然,与非冬眠动物相比,冬眠动物具有非凡的维持胞浆钙稳态的能力,并且这也促进了冬眠动物的抗废用性肌萎缩能力。但是,冬眠动物骨骼肌纤维维持胞浆钙稳态的具体机制尚不明了。在骨骼肌中,内质网作为最主要的钙库之一特化为肌浆网,一方面维持了胞浆钙浓度的平衡,另一方面又可通过其内部的Ca²⁺缓冲蛋白降低肌浆网内的游离钙浓度。废用状态下骨骼肌的一个主要表现是位于肌浆网上的Ca²⁺释放通道—兰尼碱受体（Ryanodine receptor,RyR）上调,进而引起肌浆网内的Ca²⁺释放过多造成的。肌浆网对胞浆Ca²⁺的吸收依赖于肌浆网上的钙泵（Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA）,它可以在ATP的作用下逆浓度梯度将胞浆的游离Ca²⁺泵入肌浆网。除了钙库的调节外,胞内Ca²⁺稳态的平衡还取决于细胞游离Ca²⁺与结合Ca²⁺间的动态平衡。正常状态下,90%以上的Ca²⁺以结合钙的形式被储存在不同的缓冲体中,如胞浆内的钙调蛋白（Camodulin,CaM）与肌浆网内的肌集钙蛋白（Calsequestrin,CSQ）等。基于以上内容,我们的研究主要探究冬眠中胞浆与肌浆网Ca²⁺浓度的变化,并关注肌浆网上的SERCA与兰尼碱受体通道的变化。此外,我们还关注SERCA与RyR通道的调控通路在冬眠中的变化及其对通道蛋白的影响。我们假设,冬眠动物通过调控肌浆网摄钙与排钙通道,维持肌浆网钙与胞浆钙的动态平衡,避免胞浆钙超载引起的骨骼肌萎缩。为了验证这一假设,我们检测了冬眠不同时期胞浆与肌浆网的Ca²⁺浓度、RyR与SERCA信号通路中涉及的分子的蛋白、mRNA表达水平以及部分蛋白的磷酸化水平（包括SERCA1,PLB,SLN,β-AR2,CaMK2,RyR1,FKBP12,DHPR）,RyR1与L型电压门控Ca²⁺通道（voltage-gated ion channel Dihydropyridine receptor,DHPR）、FKBP12（12 kDa FK506 binding protein）的蛋白共定位水平、SERCA与肌脂蛋白（Sarcolipin,SLN）的共定位水平,钙离子结合蛋白（CSQ1,CaM）的蛋白和mRNA表达水平,并进一步探讨参与哺乳动物冬眠中钙稳态调控的分子机制。研究方法:（1）采用单根肌纤维分离技术配合激光共聚焦显微镜检测骨骼肌胞浆与肌浆网静息Ca²⁺浓度。（2）采用蛋白免疫印迹技术（Western blot）对涉及到的靶标分子进行蛋白水平的检测。（3）采用实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR,RT-PCR）对涉及到的重要靶标分子进行转录水平的检测。（4）冰冻切片、免疫荧光组织化学技术（Immunofluorescence histochemistry,IFC）对涉及到的靶标分子间蛋白重叠程度进行相对定量检测。研究内容:本研究共选取48只达乌尔黄鼠进行不同冬眠时期（夏季对照组、冬眠前组、冬眠晚期组、阵间觉醒组、冬眠早期组与出眠组,每组8只）的研究,并选取不同类型骨骼肌（比目鱼肌代表慢肌、趾长伸肌代表快肌、腓肠肌代表混合肌）进行定量分析。（1）对不同类型骨骼肌的不同冬眠时期的肌纤维胞浆与肌浆网中静息Ca²⁺浓度进行检测,该结果作为本研究的的基础数据。（2）对肌浆网上重要的Ca²⁺释放通道—RyR1与相关调控蛋白DHPR、FKBP12（12 kDa FK506 binding protein）的蛋白和转录水平进行定量检测,并对两种分子间蛋白重叠程度进行相对定量检测,以衡量冬眠中不同时期肌浆网释放Ca²⁺的能力。（3）对骨骼肌肌浆网上最重要的Ca²⁺吸收途径—SERCA的1亚型及其关键抑制蛋白受磷蛋白（Phospholamban,PLB）和SLN的蛋白和转录水平进行定量检测,并对SERCA与SLN间的蛋白重叠程度进行相对定量检测,以衡量冬眠中不同时期SERCA吸收胞浆Ca²⁺的能力。（4）对SERCA的上游的可上调SERCA活性的信号分子—beta肾上腺素受体2（Beta-adrenergic receptor 2,β-AR2）与钙调蛋白激酶2(Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinases2,CaMK2)的蛋白表达以及CaMK2的磷酸化水平进行了定量检测,以更好的探究SERCA在冬眠中的调控机制。（5）对胞浆内的Ca²⁺结合蛋白钙调蛋白（calmodulin,CaM）和肌浆网内的Ca²⁺结合蛋白肌集钙蛋白1（calsequestrin1,CSQ1）的转录与蛋白水平进行定量检测,以衡量冬眠中骨骼肌降低胞内整体游离Ca²⁺的能力。结果及讨论:（1）冬眠晚期时三种骨骼肌的胞浆静息游离钙浓度均出现显著超载,幅度为106-213%（P<0.001）,而肌浆网钙浓度均出现降低,幅度为68-80%（P<0.001）;在阵间觉醒后刚入眠的冬眠早期组,骨骼肌纤维的胞浆与肌浆网钙浓度均恢复至夏季水平。这表明,冬眠中胞浆与肌浆网钙稳态均处于动态平衡中,阵间觉醒过程可能是二者钙稳态恢复的重要过程。（2）RyR1是骨骼肌中主要的Ca²⁺释放通道,在整个冬眠期（包括冬眠晚期、阵间觉醒与冬眠早期）中,三种骨骼肌中的RyR1的蛋白表达水平均极显著增加,增加幅度为37-107%（P<0.05）。其mRNA水平则在冬眠中三种肌肉中均不高于夏季对照组,降低25-50%（P<0.05）。DHPR的蛋白表达在冬眠中三组中显著低于夏季对照组,降低幅度为23-40%（P<0.05）。二者的共定位水平在冬眠早期组与冬眠晚期组显著低于夏季对照组。FKBP12是一种抑制RyR1活性的关键因子,其蛋白表达水平在冬眠期的比目鱼肌与趾长伸肌中均出现增加,而在腓肠肌中出现降低。其mRNA水平在三种肌肉中分别低于夏季对照组37-69%（P<0.05）不等。二者的共定位水平显示,在冬眠不同时期,三种肌肉中RyR1与FKBP12的重叠程度仅在冬眠晚期组的腓肠肌中出现增加了11%（P<0.05）。CSQ1与RyR1的蛋白共定位水平显示在冬眠中三组显著低于冬眠前对照组。这表明,RyR1的蛋白表达增加以及其与CSQ1的蛋白共定位水平降低可能导致RyR1从肌浆网中介导的钙释放增加,这可能是冬眠晚期出现胞浆钙超载的原因之一。（3）SERCA1是骨骼肌中肌浆网上最主要的Ca²⁺吸收泵,在整个冬眠期（包括冬眠晚期、阵间觉醒与冬眠早期）中,三种骨骼肌纤维的SERCA1的蛋白表达水平均极显著增加,增加幅度28-103%（P<0.05）。PLB与SLN作为抑制SERCA活性的两大关键调控因子,二者的蛋白表达水平在冬眠期的三种肌肉中升高或未出现明显变化。而PLB的磷酸化水平在比目鱼肌的阵间觉醒组与腓肠肌的冬眠早期组显著增加14-134%（P<0.05）。SLN与SERCA1的共定位水平在阵间觉醒与冬眠早期组的趾长伸肌与腓肠肌中出现增加（P<0.05）。这提示,冬眠中SERCA1介导的肌浆网吸收Ca²⁺功能可能增强,这可能是阵间觉醒或浅冬眠时胞浆与肌浆网钙稳态恢复的原因之一。（4）β-AR2可通过胞内信号级联反应上调SERCA活性,该受体蛋白表达水平在腓肠肌的阵间觉醒与冬眠早期组显著增加42-50%（P<0.05）。CaMK2,可以解除PLB对SERCA抑制,其磷酸化水平在比目鱼肌的阵间觉醒时显著增加30%（P<0.05）。这表明上调肌浆网SERCA的方式在不同类型肌肉间具有显著的肌纤维类型特异性。（5）CSQ1与CaM是两种分别位于肌浆网内和胞浆内的Ca²⁺结合蛋白,在三种肌肉中蛋白表达水平在整个冬眠期分别增加85-323%和48-136%（P<0.05）。这表明,冬眠中三种骨骼肌均具有显著的降低整个细胞中游离钙浓度的能力。结论:这些发现首次证实,在冬眠不同时期（冬眠或阵间觉醒）,SERCA1,RyR1,CaM和CSQ1的蛋白表达水平均出现显著升高,抑制SERCA活性的调控因子（受磷蛋白与肌脂蛋白）与上调SERCA活性的因子（β-AR2与CaMK2）的表达水平亦维持或高于夏季组,提示冬眠期低体温状态下的骨骼肌细胞肌质网的功能可能比非冬眠期更加活跃;通过不同信号通路上调肌质网的SERCA活性与显著上调结合游离钙离子的CaM和CSQ1表达水平,从不同维度共同构成冬眠动物维持胞内钙稳态的重要机制。