实验猪CⅡTA基因特征分析及PRRSV感染后调控SLAⅡ类分子表达的机制研究

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MHCⅡ类反式激活因子(Major histocompatibility classⅡTransactivator,CⅡTA)作为非DNA结合转录激活因子,是调控MHCⅡ类分子(Major histocompatibility complex classⅡ,MHCⅡ)表达最主要的转录分子之一,决定了MHCⅡ类分子表达的高低。CⅡTA在人上相关研究较多,但在猪上对其分子特征和调控机制研究很少。实验猪是畜禽疫病防控研究中重要的模式动物,因此,本研究以遗传背景清晰、微生物和寄生虫得到控制的无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)的长白猪、大白猪和荣昌猪为基础,对CⅡTA基因进行可变剪接分析以及研究CⅡTA剪接突变体在不同组织中的表达情况,可为培育标准化的实验猪提供遗传学参考依据,进一步探讨了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染后CⅡTA与SLAⅡ(swine lymphocyte antigen classⅡ,SLAⅡ)类分子表达的相关性,可为后续研究CⅡTA基因在机体内的免疫调控功能及相关分子通路的研究奠定理论基础。本研究以SPF大白猪、长白猪和荣昌猪为研究对象,设计一对特异性引物对CⅡTA CDS(Coding sequence,CDS)区进行扩增、克隆和测序,对获得的序列分析其剪接突变体特征,利用在线软件对不同剪接突变体进行生物信息学分析,结果显示,在SPF大白猪、长白猪和荣昌猪CⅡTA基因CDS区存在3种不同的剪接突变体(CⅡTA-A、CⅡTA-B和CⅡTA-C)。CⅡTA-A和CⅡTA-B突变体由于Exon 11部分核苷酸缺失使终止密码子提前,从而致使编码CⅡTA蛋白的结构域受到了剪接的影响,缺失了末端富含亮氨酸的4个重复结构域。进化树结果表明针对CⅡTA,猪与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,在不同猪品种中具有较高的保守性。随后利用荧光定量PCR方法检测了CⅡTA基因剪接突变体在猪8种组织中的表达模式,发现不同突变体均有表达,表达量稍有差异,突变体之间的表达量趋于一致。利用双荧光素酶报告系统检测了CⅡTA不同剪接突变体对SLAⅡ类基因启动子(DQB1、DRB1、DQA和DRA)的激活作用,结果显示蛋白结构缺失的突变体对SLAⅡ类基因启动子(DQB1和DRB1)活性具有明显的抑制作用,表明缺失突变体可抑制SLAⅡ类基因的转录活性。CⅡTA剪切突变体的亚细胞定位分析显示不同突变体在细胞质与细胞核中均有表达。本研究继续分析了猪CⅡTA对SLAⅡ类分子表达调控作用。在PAMs中通过构建重组CⅡTA慢病毒过表达CⅡTA后,利用荧光定量PCR和Western Blot方法检测了SLAⅡ类分子的表达量,结果发现SLAⅡ类分子表达上调,同时设计si RNA敲低CⅡTA的表达后,SLAⅡ类分子m RNA和蛋白表达均下调,表明在猪中CⅡTA对SLAⅡ类分子的表达具有正调控作用。其次初步探讨了PRRSV感染后CⅡTA表达与SLAⅡ类分子表达的相关性。在PAMs中过表达CⅡTA的表达,然后接入PRRSV,发现SLAⅡ类分子表达上调,而敲低CⅡTA的表达再接PRRSV后,SLAⅡ类分子表达下降。前期研究发现,PAMs感染PRRSV后,IFN-γ表达降低,并已检测不到,于是本研究通过在PAMs中外源加入IFN-γ,再接入PRRSV,检测CⅡTA和SLAⅡ类分子的表达,发现表达均升高,因此初步发现PRRSV感染早期CⅡTA表达与SLAⅡ分子有正相关作用。
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