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G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptors,GPCRs)二聚化及寡聚化是近几十年GPCRs家族备受关注的焦点之一。前期研究表明,GPCRs二聚体不仅以组成型二聚体的形式存在,在不同配体作用下还能形成诱导型的二聚体。GPCRs二聚体的成员不仅在空间结构上互相影响相互制约,而且还能影响或改变伙伴受体的内在功效与蛋白功能选择,表现出二聚体特有的信号转导特征。研究二聚体形成的具体机制,对于阐明GPCRs介导的下游信号通路及生理功能具有重要的理论意义。Apelin受体(putative receptor protein related to AT1,APJ)隶属于GPCRs中A类视紫红样受体家族,研究表明,APJ可介导心血管系统多种生理病理过程,该受体的激活还在脑缺血、帕金森及老年痴呆症的发生发展过程中发挥重要生物学作用。新近研究证实,APJ能够与多种受体形成同源或异源二聚体,如APJ-KOR二聚体等。孤啡肽受体(opioid receptor-like 1 receptor,ORL1)同属A类视紫红质样受体家族,在物质成瘾、抑郁、疼痛等疾病生理过程中具有重要作用。本实验室前期研究发现APJ与ORL1之间存在相互作用,本实验拟进一步确认APJ与ORL1的相互作用关系,探究二者相互作用的关键位点,并探讨二聚化作用对两受体下游信号通路的可能影响,以进一步了解二聚化互作关系对APJ与ORL1功能的影响,充实GPCR理论体系,为科学阐述GPCRs二聚体形成机制及对机体生理功能的调节提供实验根据。本课题首先检测SH-SY5Y细胞中APJ和ORL1两种受体的表达,同时用激光共聚焦显微镜对APJ和ORL1的亚细胞分布进行分析,并采用生物发光共振能量转移技术(bioluminescence resonance energy transfer technology,BRET)、荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer technology,FRET)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitatio,Co-IP)、原位临近连接反应(Proximity ligation assay,PLA)技术进一步验证APJ和ORL1的二聚化相互关系。在确认二者可以发生异源二聚化后,进一步探究激动剂干预下,二聚化对受体信号转导的影响。实验选取e BRET检测受体与G蛋白之间的偶联关系、c AMP水平变化;借助FLuo-4检测钙离子的变化;利用双荧光报告基因法分析下游信号元件SRE、NFAT表达;利用Western blot检测c AMP反应元件(CREB)的磷酸化样变化。同时,利用e BRET检测二聚化对APJ或ORL1与β-arrestern1/2相互作用的调节,从而进一步探讨二聚化对受体的胞内运输的可能影响。此外,采用质谱方法对APJ和ORL1异源二聚化的关键位点进行了初步的研究。实验结果显示:(1)成功构建实验所需质粒,测序正确,可用于下一步实验。(2)APJ和ORL1在SH-SY5Y细胞中存在共表达。激光共聚焦检测结果表明APJ和ORL1在细胞膜上的表达位置高度一致。(3)BRET、FRET、Co-IP及PLA技术均证实APJ和ORL1之间存在异源二聚化相互作用。(4)APJ与ORL1共表达细胞,APJ或ORL1与Gαi1的偶联活性均表现显著增强(p<0.05),与Gαq偶联均减弱(p<0.05),与APJ或ORL1独立表达组相比较,给予Apelin13或N/OFQ刺激后,APJ-ORL1共表达组细胞内钙离子含量减少(p<0.001),c AMP水平降低(p<0.05),下游信号元件SRE含量升高(p<0.01),而NFAT含量降低(p<0.05),同时CREB磷酸化水平显著削弱(p<0.05)。(5)与APJ或ORL1独立表达组相比较,APJ-ORL1共表达细胞内,APJ或ORL1与β-arrestern1/2的相互作用显著削弱(p<0.05)。(6)质谱检测显示,TM1、TM5跨膜肽是APJ和ORL1异源二聚化的关键肽段,我们通过构建、筛选突变体发现ORL1-L57A、ORL1-L229A、APJ-M36A、APJ-V80A、APJ-L218A、APJ-I224A在APJ和ORL1异源二聚化中发挥关键作用。综上所述,我们认为APJ与ORL1之间存在异源二聚化相互作用关系,且该二聚化对不仅可以抑制APJ和ORL1的内化,还可促进Gi信号通路的激活,而TM1、TM5跨膜区是APJ和ORL1异源二聚化的关键肽段。