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本试验将完全分化的小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)经渗透化处理后与小鼠类胚胎干细胞(ES细胞)裂解液共孵育,建立共孵育重编程逆转化方法,探讨诱导MEFs逆转化为多能干细胞的可能性。重点研究了小鼠类ES细胞的裂解方法及裂解液的有效提取方式、在裂解液中添加不同物质组成共孵育逆转化配方、MEFs的渗透化处理方法和MEFs在不同的共孵育体系中人工诱导逆转化为多能干细胞的效果等,旨在构建新的共孵育重编程逆转化体系提高人工诱导MEFs为多能干细胞的效率。试验一：共孵育重编程逆转化体系中小鼠类ES细胞的有效生成途径及其影响因素研究以昆明系小鼠为实验动物,采集妊娠3.5d、4d和4.5d的胚胎,分别移入DMEM培养液、DMEM+白血病抑制因子(LIF)和MEFs共培养体系中进行培养,比较内细胞团(ICM)从透明带内孵出的时间、孵化囊胚的贴壁情况以及ICM集落的形成情况,旨在筛选获取优质ICM集落的试验方法,为进一步有效分离、培养和鉴定类ES细胞并用于后续试验的裂解过程奠定基础。结果表明：妊娠3.5d的胚胎有61%为桑葚胚,需要经过4-5d的体外培养才能形成ICM集落,妊娠4d的扩张囊胚经过3-4d的共培养后形成ICM集落,妊娠4.5d的孵化囊胚经过1-2d的共培养即可形成ICM集落；ICM集落形成率差异极显著(P<0.01),妊娠4.5d的胚胎ICM集落形成率最高,其次为妊娠4d的胚胎,但妊娠4.5d冲出孵化囊胚数量明显减少；MEFs共培养体系优于DMEM和DMEM+LIF培养体系。因此,采集妊娠4d的昆明小鼠胚胎,选择MEFs共培养体系,在体外培养3～4d,能够有效地分离培养出可用于ES细胞研究的优质ICM集落。试验二：昆明小鼠类ES细胞裂解液的生成及其无细胞共孵育培养体系研究选取优质ICM集落进行传代培养得到类ES细胞集落,采用液氮冻融细胞法和显微计数细胞消失法,将类ES细胞分别在液氮中冻融3次、5次、7次和9次,比较不同试验组尚存完整细胞的个数,旨在探讨能够使类ES细胞完全裂解且细胞内大分子物质较少受到破坏的冻融临界次数,以便获得能够保持较多干细胞生理活性物质特性的无细胞共孵育培养体系。结果表明：类ES细胞裂解3次的完整细胞数与裂解5次、7次、9次差异极显著(P<0.01),裂解3次类ES细胞并未完全被破坏,还含有很多完整细胞,类ES细胞裂解5次、7次、9次完整细胞数差异不显著(P>0.05),类ES细胞集落裂解5次仍有完整细胞,裂解7次、9次无完整细胞。因此,选取液氮反复处理7次的类ES细胞裂解液用于MEFs重编程的无细胞共孵育培养体系比较合适。试验三：共孵育重编程逆转化体系中MEFs的优化选择和渗透化处理方式研究以昆明系小鼠为实验动物,采集妊娠13.5d的小鼠胚胎,分离培养MEFs并将其传至第3代,选择不同浓度链球菌溶血素O (SLO)影响MEFs细胞膜的稳定性,探讨增加MEFs细胞膜渗透性并能通过较大生理活性物质的渗透化处理方法。试验分别采用0.1U·μL-1、0.25·μL-1、0.5·μL-1、1·μL-1SLO处理MEFs,然后在显微镜下观察并记录死亡细胞数,旨在筛选渗透化处理MEFs的适宜SLO浓度。结果表明：经0.5·μL-1、1·μL-1SLO处理的MEFs死亡细胞数较多,影响MEFs逆转化为多能干细胞的效率；经0.1·μL-1、0.25·μL-1的SLO处理的MEFs死亡细胞数较少,且两处理组差异不显著(P>0.05),考虑到SLO的浓度过低很可能造成MEFs渗透化处理不完全,最终影响MEFs的逆转化效率。因此,选取0.25·μL-1的SLO作用于MEFs既有望得到较好的渗透化处理效果,又可以尽量不破坏MEFs,为进一步研究MEFs和类ES细胞裂解液共孵育重编程体系奠定基础。试验四：不同的类ES细胞裂解液共孵育培养体系诱导MEFs逆转化为多能干细胞的效果观察将经过SLO预处理的MEFs分别移入类ES细胞裂解液组(Ⅰ组)、曲古抑菌素(TSA)和SLO预处理MEFs+类ES细胞裂解液处理组(Ⅱ组)、5-氮脱氧胞苷酸(5-Aza-dC)和SLO预处理MEFs+类ES细胞裂解液处理组(Ⅲ组)、TSA+5-Aza-dC和SLO预处理MEFs+类ES细胞裂解液(Ⅳ组)四组共孵育逆转化体系中作用,并与无裂解液组作对照,对MEFs的形态学变化进行观察,并对重编程逆转化所得多能干细胞进行鉴定,研究不同的类ES细胞裂解液共孵育培养体系诱导MEFs逆转化为多能干细胞的效果,确定能够有效诱导MEFs为多能干细胞的共孵育方法。结果显示：试验Ⅳ组的非圆形细胞个数与共孵育方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间差异极显著(P<0.01),试验Ⅳ组类ES细胞集落个数明显优于其它三个处理组(P<0.01)。因此,在类ES细胞裂解液共孵育前使用TSA和5-Aza-dC两种物质预先处理MEFs更有利于提高MEFs逆转化为多能干细胞的效率。结论：采集妊娠4d的昆明小鼠胚胎,与MEFs共培养3-4d,能够获取分离培养类ES细胞的优质ICM；采用液氮反复冻融方法处理类ES细胞7次,能够获得物理方法冻融破坏比较完全的类ES细胞的无细胞裂解液；MEFs经TSA和5-Aza-dC预先处理,0.25·μL-1SLO渗透化处理后,与类ES细胞的无细胞裂解液共孵育,能够使MEFs发生逆转化,表现出多能干细胞的一些特征。试验表明：已经发生了终端分化的体细胞能够在类ES细胞裂解液活性物质的作用下发生逆转化,这种共孵育逆转化体细胞为干细胞的方法也会是一种不采用破坏胚胎途径产生自体干细胞的新途径。