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黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）是我国重要的淡水经济鱼类,在高密度养殖过程中,细菌性疾病等病害的频发对养殖生产造成严重经济损失,制约了黄颡鱼养殖业的健康发展。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是多种生物功能的关键调节因子,通过与TNF受体（TNFR1和TNFR2）相互作用,激活炎症、细胞凋亡或细胞坏死等信号通路。本课题以黄颡鱼为研究对象,获得了黄颡鱼Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因部分c DNA序列,并对其核酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析。检测了黄颡鱼Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因的在健康组织和白细胞中的分布情况,及多种PAMPs刺激后三个基因表达量的变化。检测了rPf＿sTNF重组蛋白对多种促炎细胞因子表达的调控、对下游信号通路相关基因表达的影响、促进白细胞的吞噬活性及促其凋亡的能力,并鉴定了rPf＿TNFR1CRD2/3和rPf＿TNFR2CRD2/3重组蛋白对rPf＿sTNF促吞噬活性的影响。主要结果如下:1.黄颡鱼Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因克隆和序列分析黄颡鱼Pf＿TNF-α基因编码了227个氨基酸。通过Meg Align分析其基因结构,Pf＿TNF-α与斑点叉尾鮰、斑马鱼、人类的TNF的基因结构都包含4个外显子,第四个外显子中包含了Pf＿TNF-α同源域90.53%的核苷酸。TNF-α存在一个转换酶切割位点、两个半胱氨酸残基和一段TNF家族标记蛋白序列。实验获得黄颡鱼Pf-＿TNFR1基因部分c DNA序列,包括ORF（1176 bp）和3’非翻译区（UTR）（1056bp）。Pf＿TNFR1的ORF编码了391个氨基酸。黄颡鱼Pf＿TNFR2的部分c DNA序列包括ORF（1254 bp）和3’UTR（232 bp）,Pf＿TNFR2的ORF编码了417个氨基酸。通过SMART预测Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2蛋白具有一段跨膜区,属于跨膜蛋白,胞外区具有四个半胱氨酸富集区（CRD）。Pf＿TNFR1的胞内区具有一个保守的死亡结构域,Pf＿TNFR2的胞内区有三个TRAF2结合位点。Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2与斑点叉尾鮰TNF、TNFR1和TNFR2的氨基酸序列相似性最高,分别达到79.6%、67.4%和70.8%。同样的,在进化树分析中,黄颡鱼Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因分别与鱼类的TNF-α、TNFR1和TNFR2聚类。2.黄颡鱼Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因mRNA表达分析黄颡鱼Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因mRNA在健康成鱼的14个组织中有基础表达。Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2的mRNA表达量分别在血液、鳃和肝脏中最高。然而,Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2的mRNA表达量都在肌肉中最低。在健康黄颡鱼不同组织的白细胞中,三个基因的mRNA表达量在鳃白细胞中最高;在外周血白细胞（PBLs）中次之;在体肾白细胞中较低;在头肾白细胞中最低。健康黄颡鱼被鮰爱德华氏菌感染后,Pf＿TNF-α、Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2基因的mRNA表达量在4个免疫器官和1个黏膜组织中有不同的变化。Pf＿TNF-α基因的mRNA在脾、头肾和体肾中的转录水平被显著上调。Pf＿TNFR1的mRNA转录水平在五个组织中均被显著诱导,且在脾脏中的上调幅度最大。Pf＿TNFR2基因的mRNA表达水平在细菌感染后的脾中显著上调,而在肝脏和鳃中显著下调。黄颡鱼PBLs受到LPS、PGN、Poly I:C和PHA刺激会诱导Pf＿TNF-α基因的mRNA的表达,而Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2的mRNA表达却被抑制。3.黄颡鱼rPf＿sTNF、rPf＿TNFR1CRD2/3和rPf＿TNFR2CRD2/3重组蛋白的功能分析通过生物信息学分析,获取黄颡鱼Pf＿TNF-α可溶性区域（sTNF）核酸序列,Pf＿TNFR1和Pf＿TNFR2的CRD2和CRD3结构域核酸序列（TNFR1CRD2/3与TNFR2CRD2/3）。构建重组蛋白原核表达载体pET-28a-sTNF、pET-32aTNFR1CRD2/3和pET-32a-TNFR2CRD2/3。通过E.coil原核表达系统和Ni-NTA方法获得纯化的rPf＿sTNF、rPf＿TNFR1CRD2/3和rPf＿TNFR2CRD2/3重组蛋白。rPf＿sTNF（100 ng/m L）刺激黄颡鱼PBLs 6 h可以促进多种促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-12家族和IL-17家族细胞因子）和趋化因子（CXCL1、CXCL8和CXCL11）的mRNA表达。PBLs被rPf＿sTNF（100 ng/m L）刺激6 h后,细胞的吞噬活性显著上调。然而,在rPf＿TNFR1CRD2/3和rPf＿TNFR2CRD2/3存在的情况下,rPf＿sTNF诱导的PBLs中IL-1β和IL-6基因mRNA的表达被抑制,而TNF-α基因mRNA的表达水平继续上调。同时,rPf＿sTNF的促PBLs吞噬活性的能力被rPf＿TNFR1CRD2/3和rPf＿TNFR2CRD2/3抑制。黄颡鱼rPf＿sTNF（100 ng/m L）可以显著上调PBLs中复合物I相关基因（RIPK1、TRAF1、TRAF2、TRAF5和c IAP1）,TAK1和IKKα基因mRNA的转录水平。另外,在MAPK信号通路抑制剂（VX-702）的存在下,rPf＿sTNF介导的TNF-α和IL-1β的mRNA表达受到抑制。同样地,在NF-κB信号通路抑制剂（PDTC）的存在下,rPf＿sTNF介导的TNF-α和IL-1β的mRNA表达受到抑制。黄颡鱼rPf＿sTNF（100 ng/m L）刺激PBLs后,FADD基因mRNA的表达水平和细胞凋亡率显著增加。此外,在VX-702和PDTC存在的情况下,由rPf＿sTNF触发的FADD的mRNA表达和PBLs的凋亡率显著上调。