番茄促分裂原活化蛋白激酶基因SlMAPK7的表达特性与功能分析

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促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在植物生长发育以及逆境响应中的多种信号传导途径中发挥重要的作用。MAPK信号途径在番茄生殖发育过程的功能尚不清楚。本研究在分离番茄花粉中优势表达的SlMAPK7基因基础上,以番茄品种’Micro-Tom’为实验材料,番茄SIMAPK7基因为研究对象,利用瞬时表达分析、qRT-PCR分析技术和GUS组织化学染色法研究SlMAPK7基因的亚细胞定位与组织表达特性;构建了由组成型启动子CaMV35S驱动和花粉特异启动子LAT52驱动的SlMAPK7干涉基因表达载体和由组成型启动子CaMV35S驱动的SIMAPK7过表达基因表达载体,通过对‘Micro-Tom’进行遗传转化,获得该基因功能缺失和超量表达转基因植株,利用细胞学与分子生物学技术研究其在花粉发育过程中的生物学功能,为深入了解植物花粉发育的控制机理提供研究基础。主要研究结果如下:(1)利用qRT-PCR技术分析了SlMAPK7的时空表达。比较SlMAPK7在番茄不同组织中的表达水平表明其在番茄植株的多个组织中都有表达,但在雄蕊中的相对表达量最高,根、花萼、花瓣、雌蕊次之,而在茎、叶和果实的相对表达量极低;在花发育不同时期SlMAPK7基因均有表达,在长度约4.5~6.5 mm的花蕾中表达量最高。通过构建SlMAPK7与黄色荧光蛋白YFP融合表达载体,利用基因枪介导的洋葱内表皮细胞瞬时表达发现SlMAPK7基因表达蛋白定位在细胞核和细胞膜中。(2)利用PCR技术克隆了SlMAPK7基因5’上游长度为1823 bp(-29到-1851)的启动子序列,PLACE和PlantCARE预测其不仅含有多种典型的SlMAPK启动子顺式作用元件,还含有花粉特异启动子元件:通过瞬时表达分析确定了该启动子活性,经农杆菌介导转化拟南芥,GUS组织化学染色发现,在幼苗期SlMAPK7主要集中在顶端分生组织和根尖分生组织表达,在成年植株中则集中在花器官中表达。(3)利用农杆菌介导的方法获得转pLAT52::SlMAPK7-RNAi、p35S::SlMAPK7-RNAi和p35S::SlMAPK7三种载体的转基因番茄植株,植株营养生长正常,但生殖发育不正常。转p35S::SlMAPK7-RNAi载体和转pLAT52::SlMAPK7-RNAi载体的番茄花粉粒活性分别为10%和6.73%,同对照的99.70%相比,明显下降;同时p35S::SlMAPK7-RNAi和pLAT52::SI MAPK7-RNAi转基因株系花粉萌发力下降为8.33%和6.22%,也明显地低于对照植株,超量表达的植株花粉萌发率同对照比没有显著差异:利用电镜扫描研究了转基因植株花粉形态变化,发现CaMV35S和LAT52启动子驱动的SlM4PK7干涉均会使花粉形状发生改变,导致花粉畸形。然而SlMAPK7基因超量表达对番茄花粉活力、花粉萌发力和花粉粒外部形态并没有显著影响。树脂半薄切片和透射电镜相结合观察转基因植株花蕾的发育过程发现,转CaMV35S和LAT52启动子驱动的SlMAPK7干涉载体的番茄植株在花蕾长度约6.6-7.5mm,即小孢子发育的双核期时,花粉内容物开始降解,而使花粉发生败育。对转基因番茄植株的果实观察发现,不同类型的转基因果实大小、单果重及颜色均与对照无明显差异,而转pLAT52::SlMAPK7-RNAi载体和转p35S::SlMAPK7-RNAi载体的番茄果实没有或仅有少量种子:所以SlMAPK7可能参与了番茄花粉与果实发育调控的信号传导,其作用机理有待进一步探索。
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