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研究背景脊髓损伤是一种常见的脊柱外科伤病,多见于高处坠落、交通意外、运动伤害及暴力伤害,近年来发病率逐渐增高。脊髓损伤可造成严重的感觉及运动的功能障碍,且预后较差。尤其是颈段脊髓损伤,不仅最为常见、伤情最为严重,且累及上肢及手的功能,严重损害了患者的自理能力和生活质量。探明脊髓损伤的内在病理机制,寻找有效的干预靶点,并在此基础上寻求改善脊髓损伤患者运动功能预后的方法,是该领域研究中的热点与难点。microRNA是一种通过调控靶mRNA,而调节蛋白表达功能的单链非编码RNA。近年的研究提示了脊髓损伤后出现了miRNA失调。而这些失调的miRNA从不同的途径参与到了脊髓损伤后炎症反应、细胞凋亡和轴突再生抑制的过程中。其中有研究提示miRNA-133b对于神经细胞轴突的生长具有促进作用,但目前对于其在哺乳动物脊髓损伤病理过程及再生修复中作用的体内研究尚无报道。第一部分颈脊髓钝挫伤小鼠行为学分析与miR-133b表达分析目的建立一个稳定的小鼠颈脊髓钝挫伤模型,分析其运动功能变化趋势,并明确脊髓损伤后不同时间点miR-133b表达变化。方法训练小鼠抓握能力,以完成损伤后的握力测量。实验小鼠分为。损伤组：行颈5脊髓钝挫伤造模,使用Infinite Horizon脊髓打击仪以80Kdyn剂量急性脊髓打击。；假手术组：行单纯椎板切除术。在损伤前及损伤后各时间点点进行前肢握力测量、前肢运动功能评分。在损伤后使用qRT-PCR方法检测各组小鼠脊髓损伤区成熟miR-133b表达变化。结果假手术组小鼠在术后早期因手术伤口疼痛,出现握力测量值的暂时下降。白手术后1周,伤口逐渐恢复,握力值亦逐渐恢复至术前水平。手术后,损伤组小鼠在最初1周内,四肢运动功能严重损伤,无法使用前爪进行任何动作；白7d-14d进行握力测量时,小鼠尝试抓握测量杆,但无法完成成功的抓握,或及时能够完成抓握,但无法抵抗牵拉,完成测量。白21d-56d可配合完成测量,前爪握力随时间逐渐出现轻微改善,但明显低于术前水平,表明存在严重的运动功能障碍。术后各时间点,损伤组小鼠握力值均显著低于假手术组小鼠握力值(P<0.05)。假手术组小鼠各个时间点脊髓成熟miR-133b的表达维持在稳定水平,各时间点的相对表达量值之间无统计学差异(p>0.05)。以假手术组小鼠脊髓成熟miR-133b表达作为对照组,损伤组小鼠白损伤后第1天成熟miR-133b表达略上升,但与对照组无统计学差异(p>0.05)；损伤后第3天,损伤组小鼠脊髓成熟miR-133b表达开始下降,损伤后第7天,成熟miR-133b表达降至最低值,损伤后第14天,略微回升,但仍低于对照组(p<0.05)。结论握力测量是评估脊髓损伤小鼠的前肢运动功能敏感、可靠的实验方法。而脊髓损伤后miR-133b会随时间出现显著的下调。第二部分miR-133b对下游靶基因表达的影响目的探寻脊髓损伤病理过程中miR-133b的关键下游靶mRNA,并探讨miR-133b对这些靶mRNA的调控作用。方法分别使用外源性miR-133b mimic、miR-133b抑制剂、miR-阴性对照对小鼠脊髓损伤区显微注射进行过表达、低表达和阴性对照。在损伤后各时间点采集标本,使用qRT-PCR检测小鼠脊髓损伤区成熟miR-133b表达变化。使用生物信息数据库筛选miR-133b与神经生长、细胞凋亡等相关的靶mRNA,使用qRT-PCR及Western Blot检测各组小鼠相关靶基因的表达变化。结果脊髓损伤发生后,各组小鼠损伤区成熟miR-133b表达水平均随时间发生了显著的变化。与相同时间点单纯损伤组相比,阴性对照组小鼠成熟miR-133b均无显著变化：miR-133b组小鼠各时间点成熟miR-133b表达较手术组和阴性对照组显著升高(p<0.05),其中在术后第3天达到最高值；抑制剂组小鼠各时间点成熟miR-133b表达则低于手术组和阴性对照(p<0.05)。生物信息数据库筛选出的关键下游靶基因包括RhoA、Stathmin4,而Stathmin1作为Stathmin4的同家族成员,具有高度相似的编码和结构,亦纳入研究。qRT-PCR和Western blot的结果提示单纯损伤组小鼠脊髓损伤区RhoA蛋白表达水平随时间出现上调、Stathmin1蛋白表达水平随时间出现下调；与同时间点单纯损伤组小鼠相比,miR-133b组小鼠RhoA蛋白表达水平下调、Stathmin1蛋白表达水平上调。结论外源性miR-133b mimic可通过局部注射方法被受损组织有效摄取并进入代谢环节生成成熟miR-133b,同时诱导了RhoA和Stathmin1这两种重要的神经生长调节蛋白的表达改变。提示脊髓损伤后miR-133b表达水平的变化可能通过调控RhoA/ROCK途径和Stathmin1,参与脊髓神经轴突再生修复过程。第三部分miR-133b对小鼠脊髓损伤修复再生的影响目的探讨miR-133b对损伤小鼠皮质脊髓束轴突再生、神经细胞凋亡情况的影响,评估小鼠运动功能变化。方法分别使用miR-133b mimic、miR-阴性对照和miR-133b抑制剂对脊髓损伤后小鼠损伤局部进行注射。通过握力测量评估小鼠运动功能的恢复情况；通过皮质脊髓束BDA示踪和轴突计数评估损伤后轴突再生情况；通过Western blot检测凋亡caspase 3等凋亡相关蛋白表达,评估细胞凋亡情况；通过免疫荧光GFAP与DAPI共染色评估细胞形态、生长趋势和细胞凋亡情况。结果miR-133b治疗组小鼠在损伤后第7天起部分小鼠前爪功能便出现了初步的恢复,握力随时间逐步改善。损伤后28d-56d治疗组小鼠握力较同期单纯损伤组改善。抑制剂组小鼠损伤后的前肢运动功能恢复较慢,在损伤后14天,该组小鼠仍无法完成成功的抓握测试。直到损伤后21天,小鼠握力才出现逐步改善。但各时间点该组小鼠左右前爪单独握力及双爪同时握力均明显低于同期单纯损伤组小鼠(P<0.05)。对比各组损伤区下段各切层轴突的相对计数发现,单纯损伤组小鼠与miR阴性对照组间统计学差异不明显(p>0.05)。而miR-133b组小鼠损伤区下段各切层轴突的相对计数均高于单纯损伤组(P<0.05)。通过比较各组小鼠损伤区凋亡蛋白Caspase 3表达量,评估细胞凋亡程度。结果显示在损伤后3天、7天,miR-133b治疗组小鼠损伤区Caspase 3蛋白表达均低于同时期单纯损伤组小鼠。与单纯脊髓损伤组相比,在miR-133b治疗组小鼠脊髓损伤区切片中可见GFAP标记的胶质细胞分布更加规律,且有向损伤区外长入的趋势；miR-133b组小鼠DAPI标记的凋亡细胞显著低于脊髓损伤组。结论过表达miR-133b可使小鼠脊髓损伤区的轴突向损伤区外周长入,并减少神经细胞的凋亡,最终使脊髓损伤小鼠获得运动功能的部分改善：而抑制miR-133b则明显减缓了小鼠脊髓损伤后自主修复过程。提示了miR-133b在脊髓损伤修复再生过程具有重要调节作用,并且可能成为促进修复的重要靶点。