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背景:50 Hz电磁场(50 Hz-EMF)是目前环境中普遍存在的一类极低频电磁场,其对人类健康的影响一直备受公众关注且饱受争议。中枢神经系统是电磁辐射最敏感的靶器官(系统)之一。胚胎期脑发育是中枢神经系统发育成熟的关键阶段,对电磁辐射暴露更为敏感。胚胎神经干细胞的自我更新、定向分化、迁移等过程直接影响到胚胎期脑的正常发育。既往研究发现,50 Hz-EMF暴露通过促进NSCs的增殖和分化来引起成年小鼠神经发生甚至增强了小鼠的学习记忆能力。然而,50 Hz-EMF暴露对胚胎期脑发育的影响仍存在争议且相关机制不清。因此,本实验研究通过分离培养eNSCs,建立体外细胞模型,观察50 Hz-EMF暴露对eNSCs增殖和分化的影响,从TRPCs钙通道及其直接调控eNSCs增殖和分化的bHLH相关转录因子入手,探讨相关的分子机制。方法:(1)取胚胎期约13.5天(E13.5)的胎鼠端脑组织体外培养得到eNSCs。采用目前研究中两种常见的暴露模式进行50 Hz-EMF暴露。具体的暴露条件如下:模式1:0.5、1、2m T;5分钟开/10分钟关(5 min on/10 min off);1、2、3 d;模式2:1 mT;4小时/天(4 h/d);1、2、3 d。(2)采用CCK-8、EdU、神经球形成实验、细胞周期流式分析、real time PCR、TUNEL和免疫荧光细胞化学法分别检测50 Hz-EMF暴露对eNSCs增殖、维持、分化、凋亡以及分化神经元突出生长的影响。(3)采用real time PCR、Western blot和免疫荧光细胞化学法检测50 Hz-EMF暴露对调控eNSCs增殖和分化的bHLH转录因子的影响,进一步在分子水平上验证50 Hz-EMF暴露对eNSCs细胞行为的影响。(4)采用real time PCR、Western blot检测50 Hz-EMF暴露对eNSCs分化过程中TRPCs通道的影响;采用钙荧光探针Fura 2-AM检测50 Hz-EMF暴露对eNSCs中钙离子浓度的影响;(5)采用trpc1-sirna干扰下调trpc1的表达后,观察50hz-emf暴露对enscs分化过程中相关bhlh转录因子的mrna表达、细胞内钙离子浓度的变化以及神经元的定向分化和分化神经元突出生长情况,探讨trpc1在50hz-emf暴露对enscs分化的分子机制。(6)采用spss20.0软件进行实验数据的统计分析。结果:(1)暴露模式1的(0.5-2mt,5minon/10minoff)条件下,enscs的细胞活力、edu阳性细胞数目、细胞周期分布、细胞周期相关基因(p53、p21和gadd45)、神经球直径无明显变化;分化的神经元(tuj1阳性细胞)和星形胶质细胞(gfap阳性细胞)的数目也未受显著影响;而分化过程中相关基因转录发生改变(sox2mrna降低;math1、math3、ngn1和tuj1的mrna升高)。(2)暴露模式2(1mt,4h/d)条件下,50hz-emf暴露3d后,ensc的细胞活力、edu阳性数目、初级和次级神经球数目显著增加,并且调控细胞增殖的基因(sox2、hes1和hes5)mrna表达水平在暴露1d和3d时均明显升高;50hz-emf暴露3d后,由ensc分化来的神经元(tuj1阳性细胞)数目、tuj1mrna表达以及分化神经元的突出总长度和分支数目显著增加,而星形胶质细胞(gfap阳性细胞)数目和gfapmrna以及tunel阳性细胞数目无明显改变;50hz-emf暴露3d引起分化ensc中原神经基因neurod和ngn1mrna和蛋白表达升高;50hz-emf暴露2d和3d时,分化ensc中trpc1mrna和蛋白表达升高,并且细胞内钙离子浓度增加;采用trpc1-sirna下调trpc1表达后,再进行50hz-emf暴露3d,发现50hz-emf暴露对enscs向神经元分化、分化神经元的突出生长、neurod和ngn1mrna表达以及细胞内钙离子浓度的影响得以阻止。结论:(1)50hz-emf暴露对enscs的影响依赖于具体的暴露模式。间断暴露(0.5-2mt,5minon/10minoff)未改变细胞的增殖和定向分化;相对连续的暴露(1mt,4h/d)促进enscs的增殖和向神经元的分化及其突出生长。(2)50hz-emf暴露(1mt,4h/d)引起直接调控enscs增殖和定向分化的bhlh相关转录因子的表达。(3)50hz-emf暴露(1mt,4h/d)引起分化enscs中trpc1钙通道表达及细胞内钙离子浓度升高。(4)下调TRPC1钙通道的表达可以阻止50 Hz-EMF暴露对eNSCs分化的影响,表明TRPC1钙通道介导了50 Hz-EMF暴露对eNSCs向神经元分化的促进作用。