研究背景和目的：视神经损伤是眼科临床中常见的损伤类型，常导致失明。视神经属于中枢神经，由视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)轴索组成，损伤后再生困难而难以修复。目前对于这类疾病尚无有效的治疗方式，仍以激素冲击、手术治疗、神经营养因子辅助等综合性治疗为主。由于视神经损伤后神经节细胞大量丢失及凋亡，导致视功能受损，因此减少节细胞的凋亡和提高存活率是治疗的关键。作为细胞替代治疗的方法之一，干细胞移植技术的发展为视神经损伤后的修复与再生带来了新的希望。干细胞能不断分裂进行自我复制，并根据不同的微环境和触发条件分化为不同的细胞。视网膜干细胞(retinal stem cells，RSCs)属于成体干细胞，可以分化为视网膜神经节细胞，目前在视神经损伤后的修复治疗中被作为移植的种子细胞进行研究。然而，是先在体外将干细胞诱导分化成目标细胞后再移植，还是先移植干细胞，然后在组织微环境的诱导下使其分化为目标细胞，哪一种方法效果比较好，目前争议比较多。我们希望找到既具有干细胞的增殖能力，又具有神经节细胞的部分特性，并阴性表达成熟RGC特异性标记物的细胞群，即视网膜神经节祖细胞(retinal ganglionprogenitor cell，RGPC)，避免干细胞移植后分化的不确定性，又仍有一定的增殖能力和可塑性，为将来细胞移植治疗视神经损伤提供新的帮助。细胞替代治疗还需要移植细胞定向迁移到损伤区域，和受体组织进行整合后才能发挥功能学效应。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor1，SDF-1)对于许多类型的细胞均有迁移作用，研究认为它对于干细胞的迁移有重要作用。本课题的研究目的在于探寻干细胞体外诱导分化为视网膜神经节祖细胞的方法，并研究SDF-1是否能促进RGPC定向迁移以提高移植效率，为视神经损伤修复的细胞移植替代疗法提供新的方法。方法：第一部分：诱导视网膜干细胞向视网膜神经节细胞分化方法的探讨及视网膜神经节祖细胞筛选的研究1.取E13.5的LE胚胎鼠，分离得到视网膜干细胞并进行传代培养。干细胞标记物鉴定传2代的RSC。2.分别用DAPT、BDNF、DAPT联合BDNF组和5%血清对照组诱导传2代的RSC分化14d，流式细胞仪鉴定各组细胞thy1.1的阳性率。3.分别用DAPT联合BDNF分化培养基诱导传2代的RSC1d、3d和5d，鉴定干细胞标记物nestin、ki67和视网膜神经节细胞相关标记物math5、brn3b和thy1.1的表达。第二部分：SDF-1对视网膜神经节祖细胞迁移作用的实验研究1. DAPT联合BDNF分化培养基诱导传2代RSC分化3天后取出细胞，鉴定RGPC相关标记物和细胞膜表面CXCR4受体的表达情况。2.设置SDF-1组、SDF-1联合CXCR4阻断剂(AM3100)组、空白对照组，观察各组细胞的迁移情况。3.设置不同浓度的SDF-1实验组和空白对照组，观察不同浓度下各组细胞的迁移情况。结果：第一部分：诱导视网膜干细胞向视网膜神经节细胞分化方法的探讨及视网膜神经节祖细胞筛选的研究1.传2代RSC干细胞相关标记物chx10、nestin和ki67均阳性表达，并且RGC早期相关标记物math5也阳性表达，brn3b和成熟RGC特异性标记物thy1.1阴性表达。2.各实验组与对照组之间thy1.1阳性率均有统计学差异，DAPT联合BDNF组thy1.1阳性率最高，与各组之间均有显著性差异。3. DAPT联合BDNF诱导分化培养基诱导RSC分化3d后部分细胞nestin、ki67、math5和brn3b阳性表达，thy1.1阴性表达，细胞成为既具有干细胞增殖能力，又具有部分RGC特性，同时未完全发育为成熟RGC的RGPC。第二部分：SDF-1对视网膜神经节祖细胞迁移作用的实验研究1. DAPT联合BDNF分化培养基诱导传2代RSCs分化3d后，RGPC细胞膜表面CXCR4受体表达阳性。2. SDF-1能使RGPC细胞发生迁移，AMD3100通过阻断SDF-1与CXCR4的结合降低SDF-1对RGPC迁移的趋化作用。3. SDF-1对RGPC的迁移在一定范围内受浓度梯度调控，浓度越高促迁移能力越强，当浓度达到500ng/ml时细胞迁移指数最高，达到最大趋化浓度。结论：本课题研究了提高体外RSC分化为RGC的分化率的方法，筛选了RGPC细胞群出现的大致时间，并探索了SDF-1对RGPC定向迁移的作用。1. DAPT联合BDNF能提高RSC向RGC分化的分化率。并且在分化3d开始出现RGPC。2. SDF-1能够趋化RGPC定向迁移，需要与受体CXCR4结合而产生作用，此作用可被AMD3100阻断。在一定范围内随着浓度的提升SDF-1对RGPC的趋化作用增强，在500ng/ml时达到最大趋化浓度。