香茅草是一种重要的香料植物,其主要挥发性成分柠檬醛,被广泛应用于调味料和香料的生产。然而,芳香植物产生的柠檬醛远不能满足高速发展的香料行业的需求。因此,探究影响香茅草合成柠檬醛的因素极其重要。作为植物微生物生态系统的重要组成部分,植物内生菌对香茅草产柠檬醛的影响从未报道过。为此本论文开展了如下研究内容:(1)不同生长季节的香茅草内生细菌的分离及分布规律分析:通过表面消毒的方法结合四种分离培养基,从不同季节的香茅草中分离出大量内生细菌。不同季节,可培养内生细菌的总体分布规律为:秋季>冬季>夏季>春季。其中一株内生细菌CcLf-2,在不同季节皆呈现优势分布,通过形态观察及16S rRNA鉴定其为芽孢杆菌属。CcLf-2具有明显的产香能力,顶空气相色谱质谱联用仪(HS-GC-MS)检测显示,CcLf-2的挥发性物质中有桃醛、紫罗兰酮等重要的香料物质。通过感官评定,发现分离到的内生细菌其产香规律与内生菌的析出率分布规律相反,即香茅草内生细菌析出率高的时候,其产香能力并不一定很强。。此外,通过HS-GC-MS检测不同生长季节香茅草的挥发性成分,结果表明在春夏季香茅草挥发性组分中柠檬醛的含量明显要高于秋冬季节,这一结果与产香内生细菌的分布规律一致,与CcLf-2在不同季节的分布情况也一致。初步推测香茅草产香内生细菌可能会对其挥发性有机化合物尤其是主要成分柠檬醛的含量有一定的影响。(2)用产香内生细菌处理香茅草无菌苗,并分析其产香及相关基因的表达情况:通过植物组织培养技术得到香茅草无菌苗,用优势内生菌CcLf-2以及本实验室前期分离到的一株可以产生柠檬醛的香茅草内生细菌PantoeaananatisCcSh-1分别处理香茅草无菌苗10天,检测处理与未处理以及野生香茅草幼苗的挥发性物质,并通过实时定量PCR技术分析CcLf-2和CcSh-1处理后香茅草中柠檬醛生物合成途径中相关基因的表达情况的变化。结果表明,内生细菌CcLf-2和CcSh-1可以通过影响相关基因的表达水平来促进宿主柠檬醛的合成。虽然CcSh-1能产生与宿主植物相同的次级代谢产物,但优势内生菌CcLf-2对香茅草产柠檬醛的诱导能力更强。此外,用优势内生菌CcLf-2分别处理香茅草无菌苗不同时间后,发现处理5天和10天,香茅草组培苗挥发性成分中柠檬醛含量明显升高,相关基因表达水平也有所上调。处理15天后,虽然香茅草组培苗的基因表达水平有一定的上调,但是柠檬醛含量有所降低。(3)初步研究产柠檬醛的内生细菌CcSh-1柠檬醛合成途径:CcSh-1可以产生柠檬醛,但是对香茅草中柠檬醛合成的诱导能力并不是很强。对CcSh-1进行了全基因组测序,找到其具有MEP合成途径的关键基因,以GFP为报告基因,成功预测并检测出CcSh-1中的两个强启动子。对CcSh-1中MEP合成途径相关的两个关键基因DXS和DXR进行克隆,结合强启动子构建重组载体使其在宿主菌株CcSh-1中过量表达。检测过表达菌株中柠檬醛的含量,pUC19-CcSh-l中柠檬醛的含量为0.157μg/ml,pUC19--DXS-CcSh-l中柠檬醛含量为0.172μg/ml,与对照相比有所增加,而pUC19-DXR-CcSh-l中柠檬醛含量有所减少,为0.144μg/ml,从而证明DXS和DXR基因参与了 CcSh-1MEP途径柠檬醛的合成。