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鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫引起的鸡肠道寄生虫病,严重者可导致大批鸡只的死亡,给养殖业造成严重经济损失。有报道称,每年鸡球虫病给全世界的养殖业造成了约5亿英镑的巨大损失。柔嫩艾美耳球虫(E.tenella,Et)寄生于鸡盲肠,其致病力和危害性最强,所引起的主要症状为出血性肠炎,继而血便、体重减轻等,严重者导致鸡只死亡。目前,鸡球虫病的防治主要依赖于抗球虫药物。但随着药物的不断使用,球虫几乎对所有药物都产生了一定的耐药性,从而影响了鸡球虫病的防治效果,这种现象急需解决。乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,1.DH)是糖酵解途径的末端酶,催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,与寄生虫生存密切相关。研究表明,各种寄生虫的乳酸脱氢酶在理化性质和分子结构方面均有独特的特性,是良好的诊断分子和潜在的药物作用靶标。目前,顶复器门原虫LDHs的研究主要以疟原虫和弓形虫为主,有关艾美耳属LDHs在寄生虫生长发育过程中的重要作用研究甚少。本文即以致病力最强的柔嫩艾美耳球虫(上海株)为研究对象,对其LDH的特性进行研究,为深入探讨乳酸脱氢酶在球虫发育中所承担的生理学功能以及筛选疫苗候选抗原奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫LDH基因的克隆及生物信息学分析利用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫上海株(Et-Shanghai)第二代裂殖子中克隆了LDH基因,经PCR和酶切鉴定正确后进行测序,对所获得的序列进行生物信息学分析。结果显示,克隆片段含一个长996bp的开放阅读框(ORF),该序列表达的蛋白含有331个氨基酸,理论大小约为34.96kDa,等电点为6.54。该蛋白无跨膜结构,无信号肽,在10～155位和158～315位氨基酸处为LDH的保守结构域。同源序列比对,表明Et-Shanghai LDH与Et-Weybridge LDH序列的相似性高达99%,而与已报道的巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)和布氏艾美耳球虫(E.brunetti)的LDH一致性为67%～72%。利用荧光定量PCR对柔嫩艾美耳球虫LDH基因在球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子)的转录水平进行分析,结果表明EtLDH mRNA在虫体4个阶段的含量不同,其中第二代裂殖子阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,而在孢子化卵囊和子孢子中最少。2.柔嫩艾美耳球虫LDH基因的原核表达及功能初步研究将EtLDH基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组EtLDH蛋白。SDS-PAGE电泳显示,pET28a(+)-EfLDH在大肠杆菌中得到成功表达,其分子量为39kDa左右。用纯化的rEtLDH免疫家兔获得多抗血清,利用Vestern-blot,可识别虫体4个阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)约为35kDa大小的天然目的蛋白,但表达量明显不同,与未孢子化卵囊相比,第二代裂殖子中EtLDH蛋白表达量显著增加了约62%(P<0.05),子孢子中显著降低了约44%(P<0.05),而孢子化卵囊中与未孢子化卵囊的相当(P>0.05)。采用间接免疫荧光技术对EtLDH蛋白在球虫早期发育阶段虫体中的位置进行定位,结果显示,子孢子未入侵细胞前,LDH主要集中在子孢子前半端,随着子孢子的入侵,较多的LDH集中在虫体前半端,随之,EtLDH在滋养体和未成熟裂殖体表达量增加,但是在成熟的第一代裂殖体中降低。实验中,子孢子入侵细胞后的24h至60h间,发现EtLDH定位于带虫空泡表膜上。通过体外抑制试验检测不同浓度的兔anti-rEtLDH抗体对子孢子入侵DF-1细胞的抑制率,结果显示,当anti-rEtLDH抗体IgG浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL时,其抑制率与相同浓度的兔正常血清1gG的相当,故对子孢子的入侵无明显抑制作用；当anti-rEtLDH抗体IgG浓度为400μg/mL时,子孢子的入侵能力明显减弱。3. pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ重组质粒的构建与鉴定本研究使用的真核表达载体为经过张树梅等(2011)改造的pCAGGS载体,该真核表达载体含有CMV增强子和鸡-actin启动子,具有较高的表达效率。分别以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子和鸡脾脏cDNA为模板,PCR扩增出EtLDH和鸡IFN-γ基因,PCR产物经酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建了真核表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ。所构建的真核表达质粒经酶切和测序鉴定为正确后转染293T细胞进行表达,分别用Western-blot和间接免疫荧光鉴定EtLDH基因的表达情况。Western-blot结果可见大小约为37kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光可以检测到特异性红色荧光。结果表明成功构建了EtLDH的真核重组表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ,并能在真核细胞中表达,为研究该重组质粒的免疫原性奠定了基础。