间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)免疫原性低,具有多向分化潜能,普遍存在脊椎动物的脐带、骨髓以及脂肪等组织中,获取方便,来源充足,便于实现自体细胞移植,可以作为细胞移植治疗的种子细胞。在长期培养过程中,MSCs始终保持其多向分化的潜能,包括向神经细胞的分化。在神经退行性疾病治疗过程中,由于MSCs迁移至损伤部位的细胞数量有限,给治疗带来了极大不便,因此提高MSCs的迁移能力对治疗有着重要意义。Wnt信号通路可以调节多种细胞生命活动,包括细胞的增殖、分化和迁移等过程。Wnt/β-catenin信号通路的核心是β-catenin入核与转录因子TCF结合进而启动下游靶基因的转录。我们实验室研究发现Wnt/β-catenin信号的激活能够促进MSCs的迁移。Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因是如何调控细胞的迁移,此类研究报道较少。Wnt/β-catenin的下游靶基因Nedd9(neural precursor cell expressed,developmentally down regulated 9)是一类黏着斑支架蛋白可以调控黏着斑的周转。据报道,在肿瘤细胞中,Nedd9的表达可以响应Wnt/β-catenin的变化,并影响肿瘤细胞的浸润和侵袭。本文是围绕Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因Nedd9对MSCs迁移的影响展开研究。首先分离得到SD大鼠骨髓来源的MSCs,作为实验所需的细胞材料。通过Boyden chamber装置进行群体细胞迁移分析实验,结果显示用50 ng/ml的经典Wnt信号配体Wnt3a处理MSCs,与对照组相比MSCs的迁移能力提高1.6倍,相反用5μM的Wnt/β-catenin抑制剂FH535处理后,MSCs的迁移能力下降至对照组的60%。实验结果表明,Wnt/β-catenin信号通路的激活能够促进MSCs的迁移。与此同时,Wnt/β-catenin信号通路的激活可以提高Nedd9的表达。高表达Nedd9是否同样促进MSCs的迁移,将在本课题中进行研究。我们以SD大鼠c DNA为模版克隆全长Nedd9,构建高表达Nedd9的重组腺病毒(Adenoverus,Ad)载体质粒,线性化后转入QBI-293A中进行包装和扩增,并筛选出可以感染MSCs的最适腺病毒感染复数。通过Boyden chamber装置进行群体细胞迁移分析实验,结果显示,与Ad组相比,感染Ad-Nedd9后细胞群体水平的机动性迁移能力显著性提高。据报道,MSCs表达HGF(Hepatocye growth factor)的受体c-met,体外实验表明HGF可以促进MSCs的迁移。我们以HGF作为趋化性因子研究MSCs的趋化性迁移,结果发现与Ad组相比,感染Ad-Nedd9后的细胞群体水平向HGF的趋化性迁移能力显著性的提升。同时我们发现,高表达Nedd9后,HGF处理与未处理组相比迁移的细胞数目没有显著性变化。此外,通过Dunn chamber装置,从单细胞水平研究高表达Nedd9的MSCs向HGF趋化性迁移与Ad组相比,细胞的迁移速率明显提高而迁移效率没有显著性变化。MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)信号与细胞迁移密切相关。我们实验室发现,Wnt/β-catenin信号的激活能增强MSCs的迁移能力,并且对MAPKs信号有相应的激活。那么高表达Nedd9是否也能相应地激活MAPKs信号?接下来,我们研究了Nedd9调控MSCs迁移的分子机制,通过Western blot实验检测高表达Nedd9和感染Ad的MSCs中Stress-activated protein kinases(SAPK)/Jun amino-terminal kinases(JNK)、ERK1/2(extracellular regulated protein kinases)、p38/MAPK总蛋白及其磷酸化水平的变化,发现它们的总蛋白水平及ERK1/2和p38/MAPK的磷酸化水平没有改变,而SAPK/JNK的磷酸化水平在高表达Nedd9的MSCs中显著性提高。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和桩蛋白(paxillin)都是黏着斑相关蛋白,对黏着斑的形成和周转有着重要作用,前面介绍到,Nedd9是一类黏着斑支架蛋白,有文献报道,在一些肿瘤细胞中Nedd9可以调节FAK或paxillin的活性。因此我们通过Western blot检测黏着斑相关蛋白FAK和paxillin总蛋白及其磷酸化的变化。发现,在MSCs中高表达Nedd9,FAK和paxillin总蛋白及FAK的酪氨酸397位点(Y397-FAK)磷酸化水平并没有变化,而paxillin的Y118位点(Y118-paxillin)的磷酸化水平比Ad组显著性提高。由于细胞迁移与黏着斑周转和细胞骨架重排密切相关,利用免疫荧光染色检测Nedd9对MSCs黏着斑的形成及分布、细胞骨架重排的影响。发现高表达Nedd9后,黏着斑总数增多,且向细胞周边分布,并且影响了微丝骨架的重排。体外实验发现高表达Nedd9可以促进MSCs的迁移。接着我们检测Nedd9在体内能否促进MSCs向损伤部位的迁移。我们通过构建了大鼠T10脊髓全横断损伤模型,造模7 d后,鞘注法进行细胞移植,再经过7 d后,取损伤部位脊髓进行冷冻切片,追踪移植的细胞在脊髓损伤部位前后的分布并计数。发现,感染Ad-Nedd9的MSCs定植到损伤部位的细胞数比感染Ad组的显著增多。综上所述,Wnt/β-catenin信号通路的激活促进MSCs迁移,同时提高其下游靶基因Nedd9的表达。为了研究Wnt/β-catenin信号通路促进MSCs的迁移是否通过其下游靶基因Nedd9的作用。我们构建了Nedd9的重组腺病毒载体,检测高表达Nedd9同样可以促进MSCs的迁移。本研究初步揭示了Wnt/β-catenin信号通路促进MSCs迁移的分子机制,为MSCs未来应用与临床移植治疗提供了理论基础。