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纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源。纤维素的利用与转化对于解决目前世界所面临的粮食短缺、环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。纤维素酶可以将纤维素水解成为葡萄糖,这是一条无污染且能有效利用纤维素的途径。但目前纤维素酶的成本仍较高,一些纤维素酶具有活性较低或热稳定性较差等缺点,通过定向进化可以不断提高并获得新性能的重组纤维素酶。本试验以嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因egⅠ为研究对象,通过DNA改组技术对野生型egⅠ进行突变重组,以期获得高内切葡聚糖酶活性、高稳定性的突变菌株。本研究主要结果：
⑴通过优化DNaseⅠ酶切时间、无引物PCR和有引物PCR的模板量等关键因素,建立适合于嗜热子囊菌内切葡聚糖酶基因改组的条件。
⑵以质粒pMD-18T-egⅠ为模板进行PCR扩增,获得野生型egⅠ,利用DNAshuffling技术,得到大约400个突变克隆,随机挑选20株进行测序和序列分析,突变率达0.11％～0.43％。
⑶将含有突变基因的重组质粒pMD-18T-egⅠ和酵母表达质粒pPIC9K用SnaBⅠ、NotⅠ进行双酶切,经T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α,抽提质粒,获得携带不同片段的质粒。线性化后,采用LiCl转化方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中,MD平板上筛选Mut+His+转化予。阳性转化子在基础盐培养基中诱导表达,经酶活测定,筛选出1株活性较高的菌株BY2,酶活为23.75U／mL,比出发菌株酶活提高了将近10倍。
⑷为得到高表达基因工程菌株,提取这株突变菌的基因组,以EG-S和EG-A为引物扩增该突变基因,序列分析发现该突变株为13号突变基因。突变基因与pPIC9K连接,线性化后进行电击转化。通过活性筛选,得到高活性突变体BY213,在基础盐培养基中培养168h后,酶活可达到78.63U／ml,蛋白含量达到1.14mg／mL。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,分子量为34.1KDa。
⑸研究了BY213菌株的内切葡聚糖酶酶学性质,其最适反应温度为65℃,最适pH值为3.5,在pH2.5～4.0仍表现出90％以上的酶活；55℃保温30min,酶活保持85％以上,但在pH2.5～8.5范围内稳定性较低,仅保留40％～65％的原酶活性。