论文部分内容阅读
碳酸酐酶(CA)是一类能够高效催化二氧化碳与水和碳酸与氢质子之间的可逆反应的锌金属酶。它广泛存在于动植物及微生物中,且在很多的生物过程中起着重要的作用,如CO2转移、光合作用、保持体内酸碱平衡和离子运输等。目前,碳酸酐酶被应用于生物传感器、天然活性物筛选、生物检测和CO2捕集等工艺。本研究的目的是开发一种应用于CO2捕集工艺-IVCAP工艺的耐热型碳酸酐酶。本论文将发掘到的嗜热菌Methanocella conradii HZ254的p型碳酸酐酶的基因在大肠杆菌中进行克隆和表达,并且研究该重组碳酸酐酶的酶学性质。根据NCBI上Methanocella conradii HZ254菌株的碳酸酐酶基因mtc设计引物,以原基因为模板,PCR扩增得到带有限制性内切酶Nde I和BamH I酶切位点的碳酸酐酶mtc基因序列,将其与pET-24a(+)载体进行双酶切,连接后转化入大肠杆菌JM109中。在含卡那霉素的抗性平板上筛选含有重组质粒的转化子,对转化子进行菌落PCR及限制性内切酶双酶切验证,均证实了重组质粒中已插入目的基因,经过测序后更进一步证明了实验的准确性。将所得到的工程菌命名为JM109-pET24a-mtc。通过诱导表达与SDS-PAGE电泳,结果显示有与预期分子量大小相近的,大小约为29kDa的诱导产物的条带。经测定,该表达产物具有碳酸酐酶的活性,但没有酯酶活力。本研究对工程菌JM109-PET24a-mtc的诱导表达条件进行了优化。最佳的诱导条件是重组工程菌37℃下培养4h后加入1mM的IPTG诱导剂,在30℃下诱导培养10h。这一条件考虑了重组碳酸酐酶的稳定性,时间效率,经济成本等因素。本研究对该重组碳酸酐酶的酶学性质进行了研究。酶的热稳定性研究表明,在55℃下温浴后会使酶活急剧增加。在pH6.00-7.00的范围内,酶的稳定性较好。在1mM的终浓度下,Fe2+、Mg2+、Mn2+和Ca2+均对酶有激活作用,而Cu2+和Zn2+则有明显的抑制作用。在1mM的终浓度下,F-对酶活没有明显的影响,而磺胺和I-则有比较明显的抑制作用,Br-、HCO3-、Cl-、NO3-和SO42-对酶有一定的抑制作用。