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目的:本研究拟应用华支睾吸虫感染小鼠动物模型,对感染后小鼠Th1/Th2细胞因子、血清抗体及亚类水平和T 细胞亚群进行动态观察,了解华支睾吸虫感染后宿主的免疫状态,探讨调节性T 细胞在华支睾吸虫感染免疫极化现象及其免疫调节机制中的作用。
方法:
(1)Th1/Th2 细胞因子的动态观察:BALB / c 小鼠随机分为感染组和对照组,经口感染华支睾吸虫囊蚴30 条/鼠,分别于感染后第0d、4d,1w、2w、4w、8w、12w 剖杀实验组小鼠5 只和对照组小鼠4 只,分离脾脏组织单个核细胞,调整细胞浓度为5×106/mL,用含10% FBS,10 mM HEPES,2 mM L-glutamine,100 units/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基于96 孔培养板培养,37℃、5% CO2 培养箱培养48h,收集细胞培养上清,-70℃保存备用。其中,实验组小鼠脾细胞分为ConA(5μg/mL)刺激组和ESA(30μg/mL)刺激组,对照组不加任何刺激。双抗体夹心ELISA 法测定脾细胞培养上清中IL-12,IFN-γ和IL-4 表达水平的动态变化。
(2)ELISA 法平行测定小鼠感染后第0d、4d,1w、2w、4w、8w、10w、12w 血清中抗体IgG、IgG1/IgG2a 的动态变化。
(3)流式细胞术分析华支睾吸虫感染小鼠感染后第0w,1w,4w,8w,12w T 淋巴细胞中CD4+CD25+T 细胞亚群比例的动态变化。双抗体夹心ELISA 法测定感染后不同时间点脾细胞培养上清中TGF-β表达的动态变化。
结果:
(1)脾脏细胞培养上清中IL-12 和IFN-γ的表达呈现大致相同的趋势。
与对照组相比较,自感染后第1~2w 开始上升至第4w 达到高峰开始下降,直到第12w 下降至与对照组相同水平。IL-4 的表达水平则自感染后第1w 开始持续上升,其上升趋势一直持续至感染后第12w 实验观察结束。其中,ESA 刺激组细胞因子的表达呈现出与ConA 刺激组相似的变化趋势,未加刺激组未检测出任何表达变化。
(2)小鼠血清IgG 于感染后第2w 开始升高,约在第10w 达到高峰,此后有所下降但仍高于对照组,并维持至观察结束的第12w;IgG1/IgG2a 比值感染后逐渐增高,并持续至第12w。
(3)急性感染期CD4+CD25+ T 细胞的比例及其脾脏细胞培养上清中TGF-β的表达水平均无变化,直至感染后第12w 均明显高于对照组的水平,且二者表达变化呈正相关。
结论:
(1)Th1/Th2 细胞因子及血清抗体表达变化提示华支睾吸虫感染的免疫应答发生了由感染初期Th1 优势应答向慢性感染期Th2 优势应答转变的趋势。
(2)感染慢性期CD4+CD25+ T 细胞比例及抑制性细胞因子TGF-β表达增加,初步提示调节性T 细胞参与了华支睾吸虫感染的免疫调节。