论文部分内容阅读
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的重要原因之一。全球范围内约有2亿人血清呈HCV阳性,其感染率约占全球人口的2～3%,我国丙型肝炎的患病率达3.2%。HCV是单股正链RNA病毒,其基因组大小为9.6kb,包括一个大的开放阅读框(ORF)和两侧的5’、3’非编码区(NTRs)。由于HCV感染具有严格的种属特异性,目前除了人和黑猩猩易感外,尚没有理想的丙型肝炎感染的实验动物模型。由于HCV的高变异性以及缺乏高效率的细胞培养体系和合适的HCV感染小动物模型,严重阻碍了科学家对HCV生活史、疫苗和其特异性抗病毒药物的研究。为解决上述难题,本研究通过分子克隆的方法构建了两个重组质粒pIRESneo-HCV、pLNCX-HCV,两个重组质粒在真核细胞上得到了有效表达。通过两种方式构建了转基因小鼠:(1)将重组质粒pIRESneo-HCV线性化后,通过显微注射的方式构建HCV全基因组的转基因小鼠;(2)采用逆转录病毒载体介导的方式构建HCV全基因组的转基因小鼠。结果共获得7只F0代(3只为死胎)的转基因阳性小鼠,F0代小鼠与正常小鼠交配后共繁育27只F1代转基因小鼠,其中9只呈HCV阳性。随机抽取3只F1代转基因阳性小鼠进行了RT-PCR、血清酶类测定、免疫组化及Western-bloting分析。RT-PCR检测结果显示小鼠的肝脏中有外源基因mRNA的表达;免疫组化检测结果表明了有HCV病毒蛋白的表达;ALT和AST测定结果表明了转基因阳性小鼠的肝细胞有不同程度的损伤;Western-bloting分析显示不但有HCV结构蛋白E2和core的表达,而且还有非结构蛋白NS5的表达;对小鼠两个世代观察发现:它们在外形、生长速度及繁育方面与正常小鼠无差异,表明HCV全基因组的导入对转基因小鼠的生长发育无明显影响。本研究结果为HCV全基因组转基因小鼠模型的进一步研究及对HCV致病机理、疫苗研究和抗病毒药物的筛选奠定了基础。