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目的:在体外试验系统,研究Cr(Ⅵ)在p53封闭条件下对L-02肝细胞线粒体的损害效应,为进一步探讨Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡的独立线粒体依赖性途径奠定实验基础。方法:以L-02肝细胞为受试细胞,通过MTT试验分别检测p53抑制剂(PFT-α)单独及其与Cr(Ⅵ)共处理对L-02肝细胞存活率的影响,并检测细胞核内p53蛋白表达验证PFT-α对p53的抑制作用,筛选出有效的PFT-α及Cr(Ⅵ)作用浓度。其后续试验PFT-α浓度定为20μmol/L,预处理4h,Cr(Ⅵ)浓度为20μmol/L,染毒时间为24h。将L-02肝细胞随机分成对照细胞组(第1组)、Cr(Ⅵ)染毒组(第2组)、PFT-α预处理对照细胞组(第3组)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组(第4组)、PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组(第5组)、PFT-α+NAC+Cr(Ⅵ)染毒组(第6组)。化学比色法检测细胞氧化损伤;荧光分光光度法检测线粒体通透性转运孔(PTP)、跨膜电位(△Ψm)的变化;western blotting检测细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)的蛋白含量;RT-PCR检测Bcl-2及Bax的基因表达水平;DNA ladder检测细胞凋亡。结果:1.20μmol/L PFT-α预处理细胞后可以明显抑制细胞核内p53蛋白表达水平。2.染毒处理细胞氧化损伤:Cr(Ⅵ)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组与PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组引起SOD、GST活性明显降低,GSH含量减少,MDA生成增多,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05);加入NAC后有明显保护作用。3.细胞线粒体膜损伤:与对照组相比Cr(Ⅵ)染毒组、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组和PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞线粒体膜电位(△Ψm)降低,PTP开放度增加,差异有显著性(P＜0.05)。加入NAC后有相应的拮抗作用。4.细胞凋亡相关调控因子释放:与对照组相比Cr(Ⅵ)染毒组、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组与PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞胞浆CytC和AIF蛋白增加,加入NAC后均出现明显减少(P＜0.05)。5.Bcl-2及Bax基因表达水平改变:与对照组相比Cr(Ⅵ)染毒组、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒组与PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞Bcl-2和Bax基因表达减少,加入NAC后均出现相应基因表达的增多。6.细胞核DNA损伤:Cr(Ⅵ)、PFT-α+Cr(Ⅵ)与PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒组细胞均出现凋亡典型的DNA梯带降解现象,加入NAC后未见明显保护作用。结论:p53封闭条件下,20μmol/L Cr(Ⅵ)能明显引起L-02肝细胞氧化应激,导致线粒体膜损伤、cyt C与凋亡诱导因子(AIF)释放与细胞DNA损伤;同时在抑制caspase条件下,受试细胞仍然表现凋亡现象。结果提示,Cr(Ⅵ)可能绕过p53/caspase环节直接通过损伤细胞线粒体而诱导凋亡。