论文部分内容阅读
研究背景和目的:肾脏纤维化因创伤、感染、炎症、血流微循环障碍及免疫反应等因素所致,特点为细胞外基质沉积,是终末期肾功能衰竭的重要原因。沉默调节因子6(Sirtuin 6,SIRT6)与沉默信息调节因子2同源,影响多种信号通路,参与调控细胞寿命,在器官纤维化疾病进程中有重要意义。但目前SIRT6与肾脏纤维化的关系尚待进一步研究。本研究采用小鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)的方法构建肾脏纤维化模型,并以肾脏肾盂原位注射SIRT6过表达腺病毒为干预处理,观察SIRT6在UUO模型中的表达,探索SIRT6是否调节肾脏纤维化,并初步探讨其机制,为肾脏纤维化疾病的预防和治疗提供新思路。方法:选用30只健康清洁级雄性基因野生型C57BL/6J小鼠,随机分为3组,每组10只,分别命名为假手术组(Sham组)、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对照组(UUO+EGFP组)、过表达SIRT6组(UUO+SIRT6组)。Sham组开腹后游离左侧输尿管但不结扎,UUO+EGFP组和UUO+SIRT6组均结扎左侧输尿管建立UUO模型。UUO+SIRT6组给予肾脏肾盂原位注射SIRT6过表达腺病毒50μl(即6x10~9 PFU/ml),UUO+EGFP组以相同方法注射EGFP对照腺病毒50μl(即6x10~9 PFU/ml)作为对照。手术7天后取材,取左侧肾脏,观察肾脏形态,制作病理切片,应用HE染色、Masson染色、天狼猩红染色、免疫组化染色观察肾脏组织结构变化;检测羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量评估纤维化;应用免疫蛋白印迹(Western blot)和实时荧光PCR,观察纤维化标记物(α-SMA、Collegan-I)、致纤维化因子(TGF-β1)及SIRT6等的蛋白相对表达量和mRNA表达水平,并对SIRT6与α-SMA、Collegan-I、TGF-β1的表达水平进行相关性分析。结果:1.各组小鼠肾脏组织的SIRT6表达水平Sham组SIRT6在肾间质及小管正常基础表达;UUO+EGFP组SIRT6蛋白及mRNA表达水平较Sham组下降(P<0.05);给予SIRT6过表达腺病毒注射后,UUO+SIRT6组SIRT6蛋白及mRNA表达水平较UUO+EGFP组显著升高(P<0.01)。此项结果为本实验的基础。2.SIRT6对肾脏结构的影响制作各组小鼠肾脏病理切片,行HE染色、Masson染色、天狼猩红染色和免疫组化染色。(1)HE染色:Sham组小鼠肾脏组织未见异常;与Sham组相比,UUO+EGFP组小鼠肾脏损伤程度明显增加(P<0.01);经SIRT6过表达处理后,UUO+SIRT6组损伤程度较UUO+EGFP组下降(P<0.05)。(2)Masson染色:UUO+EGFP组较Sham组肾脏纤维化明显,大量胶原纤维堆积于肾间质被染为蓝色(P<0.01);经SIRT6过表达处理,UUO+SIRT6组纤维化程度较UUO+EGFP组减轻(P<0.01)。(3)天狼猩红染色:与Sham组相比,UUO+EGFP组肾脏纤维化明显,大量红色胶原纤维沉积于肾间质(P<0.01);经SIRT6过表达处理,UUO+SIRT6组病变程度较UUO+EGFP组减轻(P<0.01)。(4)免疫组织化学染色:UUO+EGFP组肾间质及肾小球基底膜区域棕黄色明显,肾脏组织α-SMA及Collegan-I表达水平较Sham组增高(均P<0.01)。给予SIRT6过表达处理后,UUO+SIRT6组肾脏α-SMA及Collegan-I表达较UUO+EGFP组明显减少(均P<0.01)。3.SIRT6对各组小鼠肾脏组织HYP含量的影响UUO+EGFP组HYP含量(0.22±0.03μg/mg)较Sham组(0.12±0.02μg/mg)升高(P<0.05),给予SIRT6过表达处理后,UUO+SIRT6组HYP含量(0.18±0.01μg/mg)较UUO+EGFP组减低(P<0.05)。4.SIRT6对肾脏纤维化标志物表达水平的影响与Sham组相比,UUO+EGFP组肾脏纤维化标志物α-SMA、Collegan-I及TGF-β1的蛋白及mRNA表达水平升高(均P<0.05);与UUO+EGFP组相比,给予SIRT6过表达处理的UUO+SIRT6组上述标志物的蛋白及mRNA表达水平均降低(均P<0.05)。在小鼠UUO模型中,SIRT6的表达水平与α-SMA(r=﹣0.474,P=0.027)、Collegan-I(r=﹣0.516,P=0.024)及TGF-β1(r=﹣0.507,P=0.040)均呈负相关。结论:1.过表达SIRT6可改善小鼠UUO模型肾脏纤维化,对肾脏有保护作用。2.SIRT6的肾脏保护机制可能与其下调纤维化因子α-SMA、Collegan-I及TGF-β1表达有关,有可能成为肾脏纤维化治疗的新靶点。