目的:鸟结核分枝杆菌（Mycobacterium avium,MAV）是目前最为普遍和常见的一种致病性非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria,NTM）,寻找MAV的致病因子并研究其相关致病机制,对于防治MAV和研究新疫苗均有重要意义。PE/PPE家族蛋白主要分布在致病性分枝杆菌中,可调节宿主的先天免疫反应,与致病性分枝杆菌的发病机制有关,并可作为潜在的疫苗成分。本研究运用生物信息学方法分析PPE25-MAV蛋白的结构与功能,诱导表达并纯化得到纯化的PPE25-MAV蛋白,初步探索PPE25-MAV蛋白在体内与体外诱导小鼠免疫细胞的凋亡情况和免疫学机制。方法:1.从NCBI数据库获取MAV＿2928基因编码的蛋白的氨基酸序列信息;运用在线数据库或软件预测分析PPE25-MAV蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽、亚细胞定位、蛋白跨膜区、蛋白磷酸化位点、结构和抗原表位。2.探索较佳表达条件,诱导重组质粒大量表达PPE25-MAV蛋白,并利用镍-琼脂糖凝胶层析柱纯化。3.纯化的PPE25-MAV蛋白用于体外作用小鼠脾脏淋巴细胞,以及给BALB/c小鼠皮下注射和腹腔注射纯化的PPE25-MAV蛋白后分别提取小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,并用Western Blot检测细胞NLRP3、ASC、caspase1-p20以及凋亡相关蛋白caspase3、8、9的表达量。4.ELISA检测小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量。结果:1.生物信息学分析发现MAV＿2928基因的全长为1266bp,编码的PPE25-MAV蛋白包含421个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白,脂肪系数为72.66,无信号肽及跨膜区,大概率位于细菌细胞膜上;有52个磷酸位点和1个保守域结构;二级结构以无规则卷曲为主,是一个单体蛋白,结构相对疏松;预测了PPE25-MAV含有7个B细胞的优势抗原表位以及24个Th细胞表位。2.成功表达并纯化到目的蛋白并鉴定为PPE25-MAV蛋白。3.PPE25-MAV蛋白经皮下注射和腹腔注射给小鼠后可分别引起小鼠脾脏淋巴细胞凋亡和腹腔巨噬细胞凋亡,在体外实验中主要是引起小鼠脾脏淋巴细胞的晚期凋亡。4.PPE25-MAV蛋白可激活小鼠脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体,相关分子NLRP3、ASC和caspase1-p20表达增加,炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α分泌量增加,凋亡途径相关的caspase分子caspase8以及caspase3、9活化片段增加。结论:1.PPE25-MAV蛋白具备多个磷酸化位点在参与细胞信号的转导中起重要作用,含有7个B细胞优势的抗原表位和多个Th和CTL细胞抗原表位,为该蛋白作为候选疫苗抗原提供了理论基础。2.成功表达并纯化得到的PPE25-MAV蛋白能诱导小鼠脾脏淋巴细胞和腹腔巨噬细胞凋亡,炎性细胞因子表达量增加,并激活NLRP3炎症小体,引起炎症反应。3.PPE25-MAV蛋白诱导小鼠腹腔巨噬细胞和脾脏淋巴细胞凋亡的免疫学机制主要是通过激活caspase9并切割下游的caspase3形成cleavd-caspase3降解细胞必需的生存底物导致细胞凋亡。