目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的常见并发症,其早期的病理变化包括肾小球的超滤过、肾小球和肾小管上皮细胞肥大、微白蛋白尿的出现,伴随肾小球和肾小管基底膜增厚、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)堆积,最终导致肾小球硬化和终末期肾衰竭。研究表明,细胞因子和生长因子与包括糖尿病肾病在内的多种肾脏疾病的发生、发展有密切联系,与糖尿病肾病发病最密切的细胞因子有angiotensin II、MCP-1、ICAM-1、IL-6和TGF-β等。Janus kinase(JAK)/ signal transducer and activators of transcription(STAT)介导信号通路是一条重要的信号通道,可以介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号转导过程,与细胞的增殖、分化与凋亡等多种行为密切相关。研究证实,JAK/STAT信号通路的激活在糖尿病肾病发病过程中发挥重要作用。细胞因子信号转导抑制蛋白(suppressors of cytokine signaling,SOCS)家族是新近发现的一类由细胞产生可反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子,通过参与负调控多种细胞因子介导的信号通路,最终影响细胞的增殖、分化与凋亡等基本生物学行为。SOCS对JAK/STAT信号通路的负调控作用已被肯定。目前,有关SOCS对糖尿病肾损伤作用的研究鲜见报道。本研究应用糖尿病小鼠模型和高糖培养肾小球系膜细胞,从整体、细胞和分子等不同水平,系统观察了SOCS-1基因过表达对糖尿病肾脏细胞的作用及相关分子机制。方法:1小鼠糖尿病模型的制备及活体SOCS-1基因转染CD-1雄性小鼠随机分为4组:正常对照组(N)、糖尿病组(DM)、糖尿病+空质粒组(DM+V)和糖尿病+SOCS-1质粒组(DM+S1)。DM、DM+V与DM+S1组小鼠腹腔单次注射链脲佐菌素150mg/kg(STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5),对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++～++++者确定为DM模型。DM+S1组小鼠给予尾静脉快速注射pEF-FLAG-I/mSOCS-1质粒(1 mg/kg);DM+V组用同种剂量和方法注射pEF-FLAG-I空质粒。此后每隔7天注射一次,于STZ注射后4周每组取6只小鼠,切取肾脏。取部分肾皮质组织置于4%多聚甲醛固定用于光镜观察及免疫组织化学染色;部分肾皮质组织用于提取蛋白及RNA。免疫组织化学染色法检测F4/80、MCP-1、ICAM-1和TGF-β1的表达;Western blot检测SOCS-1、p-STAT1、MCP-1、ICAM-1及TGF-β1的表达;半定量RT-PCR检测TGF-β1和MCP-1 mRNA的表达。2过表达SOCS-1系膜细胞系的建立及相关指标的检测应用脂质体2000,将pCR3.1/SOCS-1及pCR3.1空质粒转染人系膜细胞(HMC),24h后用G418(0.5 mg/ml)筛选阳性克隆(共筛选4周),建立稳定表达SOCS-1人系膜细胞系。无血清RPMI-1640培养基同步培养24h,分别用NG(5.5mmol/L葡萄糖)、HG(30mmol/L葡萄糖)和NG+M(24.5mmol/L甘露醇)刺激,于1、2、4、6、12、24和48h收集细胞及上清液,提取总蛋白及RNA。Western blot方法检测系膜细胞SOCS-1、p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、JAK2、STAT1和STAT3的表达情况;半定量RT-PCR方法检测系膜细胞SOCS-1 mRNA及TGF-β1 mRNA的表达;ELISA法检测细胞上清TGF-β1和FN的含量。结果:1过表达SOCS-1糖尿病小鼠肾皮质单核/巨噬细胞浸润、MCP-1、ICAM-1及TGF-β1表达①免疫组化显示:与正常对照组(N组)相比,DM和DM+V组F4/80阳性细胞、MCP-1、ICAM-1和TGF-β1蛋白表达显著增加;DM+S1组则明显低于DM+V组。②Western blot结果显示:与N组比较,DM和DM+V组MCP-1、ICAM-1及TGF-β1蛋白表达明显升高,DM和DM+V组之间无明显差异;DM+S1组各指标的蛋白表达则明显低于DM和DM+V组。③RT-PCR结果显示:与N组比较,DM和DM+V组MCP-1和TGF-β1 mRNA表达明显上调;DM+S1组则显著降低。2高糖环境下培养的人系膜细胞JAK/STAT信号的激活以及SOCS-1、TGF-β1和FN的表达①Western blot结果显示:高糖刺激系膜细胞1h, SOCS-1蛋白表达明显升高,4h达到峰值,然后逐渐减低,24h达基线水平。高糖刺激系膜细胞JAK2、STAT1和STAT3蛋白磷酸化明显增强,12-24h达高峰,持续至48h。SOCS -1转染组JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化水平低于对照组。②RT-PCR结果显示:高糖刺激系膜细胞1h,SOCS-1 mRNA表达明显升高,4h达峰值,然后逐渐降低,24h达基线水平。高糖刺激48h,与对照组相比,系膜细胞TGF-β1 mRNA表达水平明显上调;SOCS-1转染组TGF-β1 mRNA表达降低。③高糖刺激48h的系膜细胞上清液中TGF-β1和FN蛋白含量增加,与对照组差异显著;SOCS-1转染组的上清中TGF-β1和FN含量明显减少。结论:1肾脏过表达SOCS-1基因能够减轻糖尿病早期肾脏的肥大,抑制STAT1的激活、单核/巨噬细胞的积聚、MCP-1、ICAM-1以及TGF-β1的表达,提示SOCS-1可减轻糖尿病早期肾脏的炎症反应。2 SOCS-1过表达能够抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞JAK/STAT信号通路的激活以及TGF-β1及细胞外基质蛋白FN过度分泌,同时下调TGF-β1 mRNA的表达。提示SOCS-1抑制高糖诱导TGF-β1和FN过度分泌部分是通过抑制JAK/STAT信号通路活化实现的。